兔出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV)引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、致死性和以全身实质器官出血为主要特征的传染病。RHDV是杯状病毒科成员,结构简单,仅有一个主要结构蛋白VP60,研究发现RHDV在兔体内可以诱导机体产生很强的体液免疫应答、细胞免疫应答和粘膜免疫应答,而且RHDV还有极强的诱导干扰素产生的能力。为了探究兔出血症病毒样颗粒(RHDV-VLPs)容纳外源抗原决定簇的能力,本文主要通过对RHDVVP60N端不同位点进行缺失和取代,研究VP60基因N端序列对RHDVVLPs影响,并以运载的OVA257.264CD8+T细胞(SIINFEKL)表位为参照,通过电镜观察和动物实验,研究VLPs组装所展示外源表位的长度、构象和抗原性,初步评价RHDV VLPs其作为外源表位展示系统的可行性并且为RHDV衣壳蛋白的形成机制和其它方面提供参考依据。主要的试验和结果如下：1.重组穿梭载体的构建通过SOE法对RHDV VP60基因序列的N端进行部分缺失或用CD8+T细胞表位(SIINFEKL)替换RHDV衣壳蛋白VP60的特定区域,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T vector,经酶切鉴定后、将目的片段连接至真核表达载体pFastBacTM1,并对目的片段进行测序,获得的阳性重组质粒转化DH10Bac菌,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组质粒,分别命名为N1、 N2、I1、12和D1。2.蛋白表达及鉴定将获得的阳性重组质粒转染Sf9细胞。逐日观察细胞,当出现明显的细胞病变时,收获病毒。提取细胞内总RNA进行RT-PCR扩增,阳性样品作为重组杆状病毒原液进行扩增和传代,并通过间接免疫荧光(IFA)、血凝试验(HA)、蛋白质电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)等试验鉴定蛋白的表达。RT-PCR结果显示5种重组杆状病毒在转染的细胞中发生转录；IFA结果显示5种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳结果显示,5种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,且大小约为60kDa; Western-blot结果显示,5种嵌合蛋白(N1、N2、I1、12和D1)均能被RHDV单抗A3C特异性识别,证明5种嵌合蛋白的载体具有良好的反应原性；本试验中表达的5种嵌合蛋白,仅N1和N2有血凝性。3.嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性对昆虫杆状病毒表达系统表达的5种嵌合蛋白进行电镜观察,初步纯化4种嵌合蛋白(N1、N2、I1、12)免疫接种7-8周龄C57BL/6雌性小鼠,设RHDV-VLPs-VP60、无菌PBS为对照,共免疫三次,每次间隔两周,分别在二免及三免后两周摘眼球取血,脱颈处死小鼠,无菌取脾。间接ELISA测定Od、28d、42d血清中VP60抗体水平；分离淋巴细胞,ELISPOT检测特异性分泌IFN-y水平。结果显示：5种嵌合蛋白中,N1、N2可形成完整的VLPs,大小约为40nm,形态与天然兔出血症病毒样粒子类似；I1、I2形成的病毒样粒子较小约30nm；D1形成VLPs数量很少,几乎不可见.4种嵌合蛋白(N1、N2、I1、12)通过腹腔注射途径免疫均可诱导小鼠产生抗载体VP60的体液免疫应答和针对外源T细胞表位的细胞免疫应答,其中I1、I2所引发的针对载体特异性抗体水平和细胞免疫应答水平均较高,而N1、N2较低。可初步推测,VP60第196～229位aa区域可能是N端携带外源T细胞表位的较优区域。本文构建整合CD8+T细胞表位的嵌合蛋白。该T细胞表位来自鸡源卵清蛋白OVA257-264(SIINFEKL),受MHCI类分子限制。T细胞表位分别嵌合在RHDV VLP的不同位置：1)直接插入VP60的N末端(N1)；2)取代VP60N端2～13位氨基酸残基(N2)：3)缺失、取代VP60N端196～207位氨基酸残基(D1和I1)；4)取代VP60N端217～228位氨基酸残基(I2)。嵌合RHDV病毒样粒子作为疫苗载体的研究结果表明,RHDV-VLPs-OVA不同程度的诱发特异性抗VP60的体液免疫应答和特异性IFN-y分泌。本研究为以RHDV VLPs为载体的多价疫苗研究提供理论依据,为后期评价RHDV VLPs展示系统奠定了基础。