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目的:研究巨噬细胞线粒体 Sirt3基因的表达对线粒体蛋白去乙酰化的诱导作用对巨噬细胞功能的影响,从而探索其与巨噬细胞泡沫化的关系及作用机制,及对动脉粥样硬化进程的影响。 方法:为了提供有说服力的结果,分别对 Sirt3基因进行干扰与过表达,从正反两方面进行下列研究: 1.构建Sirt3干扰及过表达慢病毒载体。 2.以C57BL/6 J小鼠为模型动物,构建Sirt3基因干扰及过表达小鼠模型,并以C57 BL/6J小鼠为对照分组进行高脂与普通饲料饲养,于饲养的0、4及8周采集血样进行血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、白介素6和 C-反应蛋白的检测;同时解剖小鼠,取其颈总动脉进行 HE、弹力纤维染色及 Masson染色检测;以 RT-PCR检测小鼠颈动脉血管组织Sirt3基因表达,以 WB检测小鼠颈动脉血管组织 Sirt3蛋白及IDH2蛋白乙酰化检测。 3.通过腹腔灌洗法收集 C57BL/6J小鼠巨噬细胞,构建 Sirt3基因干扰及过表达巨噬细胞模型,并与 ox-L DL共培养后, RT-PCR检测 Sirt3基因表达,以 western blotting(WB)检测Sirt3及乙酰化ID H2蛋白检测,并以尼罗红染色流式分析细胞内脂质含量。 结果: 1.干扰及过表达载体构建:以慢病毒为载体,酶切电泳及测序均证实,成功构建了靶向Sirt3的干扰病毒载体GPH-SIRT3-SH2及过表达病毒载体LV5-Sirt3,其滴度均为3×108 TU/ml。 2.动物实验: 血清学指标:高脂饲养实验组血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、白介素6与 C-反应蛋白均高于普通饲料饲养组(p<0.05),提示高脂模型小鼠建模成功。 S irt3干扰小鼠经高脂饲养后,血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及白介素6与C-反应蛋白明显高于正常组及过表达组(p<0.05),但高密度脂蛋白胆固醇无统计学差异(p>0.05);而过表达组与正常组差异不明显(p>0.05); S irt3 mR NA表达及蛋白含量与乙酰化 IDH2含量:干扰组小鼠Sirt3 mRNA表达及蛋白较对正常照小鼠及过表达小鼠明显降低(p<0.05),乙酰化IDH2蛋白含量增高(p<0.05);过表达组Sirt3 m RNA表达及蛋白较正常对照组增加(p<0.05),但I DH2蛋白乙酰化水平无统计学差异(p<0.05)。 血管病理学检查:HE染色显示,通过对干扰及过表达正反研究发现,相同高脂饲养条件下S irt3表达被干扰后,C57BL/6 J小鼠颈动脉血管壁增生明显;Mas son及弹力纤维染色显示血管局部胶原纤维增生,弹力纤维退化;而过表达Sirt3则能有效减缓这一病理进程。 3、细胞学实验: 巨噬细胞经Sirt3慢病毒感染后正反研究显示:当Sirt3基因表达被干扰后,细胞线粒体IDH2蛋白乙酰化程度升高;而Sirt3处于过表达时,IDH2蛋白乙酰化程度最低。Sirt3干扰后,巨噬细胞内ox-LDL蓄积程度较正常巨噬细胞及过表达组严重,而过表达组则少见脂质蓄积; 结论:通过动物在体实验发现 Sirt3在高脂饲养小鼠中表达量的改变后,设计构建以慢病毒为 Sir t3载体进行在体干扰及过表达实验,探索 Sirt3表达量的改变对高脂饲养小鼠模型的作用。因 Sirt3存在于所有细胞的线粒体中,因此,通过分离巨噬细胞进行体外细胞学实验,对巨噬细胞线粒体中 Sirt3进行干扰及过表达,研究其对巨噬细胞生理功能的影响。从而分别从动物模型及细胞水平,以及正反两方面,证实了Sirt3表达量的改变影响巨噬细胞线粒体IDH2蛋白的乙酰化水平,从而干预细胞功能,改变其在动脉粥样硬化中的作用进程。