砷化物作为人类确定致癌物广泛存在于环境中,其中最主要的存在形式为亚砷酸钠(NaAsO2)。长期暴露于砷化物会引发多种疾病,其中最主要、最严重的当属皮肤癌。皮肤癌是一种常见的恶性肿瘤,其发病率一直居高不下,而由地方性砷中毒引发的皮肤癌更是对当地人群的健康构成了重大的威胁。寻找皮肤癌早期诊断、靶向治疗的生物标志物一直是环境毒理学领域关注的重点和热点。目前,诸多研究显示：炎症和微小RNAs (miRNAs)与人类皮肤癌发生发展密切相关,但是,其参与肿瘤发生发展的分子机制尚不清楚。炎症微环境的改变是肿瘤发生的重要因素,细胞炎性因子的分泌能诱发细胞内环境紊乱、从而促进肿瘤的发生发展。上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)参与了多种疾病过程,并且是恶性肿瘤发生发展中的关键环节。长期暴露于低浓度砷化物会导致皮肤组织损伤,诱发炎症反应并促进皮肤癌发生。由于EMT被视为炎症与肿瘤之间的桥梁,而炎症可通过激活下游信号通路调控相关miRNAs促进EMT发生。其中STAT3 (signal transducers and activators of transcription 3)信号通路的激活与miR-21的表达水平密切相关。MiR-21作为最早被发现的致癌miRNAs之一,参与细胞生长、凋亡、迁移、入侵和调控EMT过程。而NaAsO2可引起皮肤细胞炎症微环境改变及其在慢性处理所致皮肤细胞EMT和恶性转化过程中作用及其分子机制目前尚未见报道。为此,本研究利用课题组前期成功构建的NaAsO2慢性处理所致人角质形成细胞(HaCaT)细胞恶性转化模型,应用多种分子生物学方法探讨炎性细胞因子白细胞介素-6 (Interleukin 6, IL-6)对STAT3信号通路及miR-21表达水平的影响,拟揭示炎症反应和EMT在NaAsO2所致HaCaT细胞恶性转化过程中的作用及其部分分子机制,为研究砷化物等环境化学物所致皮肤损伤和皮肤癌的分子机制提供一定的科学线索,进而为寻找环境化学物所致皮肤损伤和皮肤癌早期诊断、改善预后的生物标志物提供一定的科学依据。方法一、亚砷酸钠对HaCaT细胞发生EMT的影响用0.0或1.0 μM NaAsO2分别诱导]HaCaT细胞发生恶性转化,慢性处理HaCaT细胞至30代(约15 w)后,获得0、10、20和30代对照HaCaT细胞(HaCaT-C)和砷处理HaCaT细胞(HaCaT-As),用Western blot检测细胞E-cadherin和vimentin水平。以观察NaAsO2对HaCaT细胞发生EMT的影响。二、亚砷酸钠对HaCaT细胞IL-6水平的影响用0.0或1.0μMNaAsO2分别慢性处理HaCaT细胞0、10、20和30代后：或用0.0或1.0μMNaAsO2分别急性处理HaCaT细胞0、6、12和24 h后,分别用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附(ELISA)实验检测细胞IL-6表达和分泌水平。以观察NaAsO2对HaCaT细胞IL-6 mRNA表达水平和分泌水平的影响。三、亚砷酸钠对HaCaT细胞STAT3激活的影响用0.0或1.0μMNaAsO2分别慢性处理HaCaT细胞30代(约15 w)后；或用0.0或1.0μMNaAsO2分别急性处理HaCaT细胞0、15min、30min、1、3和6h后,用Western blot检测细胞STAT3及其磷酸化程度。以观察NaAsO2对HaCaT细胞STAT3激活的影响。四、亚砷酸钠对HaCaT细胞miR-21水平的影响用0.0或1.0μMNaAsO2分别慢性处理HaCaT细胞30代(约15w)后；或用0.0或1.0μMNaAsO2分别急性处理HaCaT细胞0、6、12和24 h后,用实时定量PCR (qRT-PCR)检测细胞miR-2l水平。以观察NaAsO2对HaCaT细胞miR-21水平的影响。五、IL-6在HaCaT细胞中亚砷酸钠所致STAT3激活和miR-21水平升高的作用用0.5 μg/mL anti-IL-6中和抗体或anti-IgG抗体处理HaCaT细胞3h后,再将该细胞暴露于0.0或1.0μMNaAsO2 24h,用Vestern blot检测细胞STAT3及其磷酸化程度,用qRT-PCR检测细胞miR-2l水平。以观察IL-6在NaAsO2所致HaCaT细胞STAT3激活和miR-21水平上升中的作用。六、STAT3在HaCaT细胞中亚砷酸钠所致miR-21水平升高的作用用25 nM STAT3 siRNA或Con siRNA分别预处理HaCaT细胞24 h,再将预处理后的细胞暴露于0.0或1.0 μM NaAsO2 24 h,用Western blot检测细胞STAT3及其磷酸化水平,用qRT-PCR检测miR-21水平。以观察关闭STAT3对NaAsO2所致HaCaT细胞p-STAT3和miR-21水平升高的影响。七、STAT3调控miR-21在亚砷酸钠慢性处理所致恶性转化HaCaT细胞发生EMT中的作用分别用25 nM STAT3 siRNA或Con siRNA处理由1.0μMNaAsO2慢性处理30代所致恶性转化HaCaT (HaCaT-30T)细胞24 h；分别用80 nM miR-21 mimic或miR-NC mimi处理由HaCaT-30T细胞24 h；分别用25 nM STAT3 siRNA或Con siRNA预处理HaCaT-30T细胞24 h,再分别用80 nM miR-21 mimic或miR-NC mimi处理该细胞24 h。用Western blot检测细胞STAT3及其磷酸化水平,用qRT-PCR检测细胞miR-21水平,用Western blot和免疫荧光实验检测E-cadherin和vimentin表达水平。以观察STAT3调控miR-21在亚砷酸钠慢性处理所致恶性转化HaCaT细胞发生EMT中的作用。八、STAT3调控miR-21对亚砷酸钠慢性处理所致HaCaT细胞恶性程度和侵袭转移能力的影响分别用25 nM STAT3 siRNA或Con siRNA预处理HaCaT-30T细胞24 h,再分别用80 nM miR-21 mimic或miR-NC mimi处理该细胞24 h,用软琼脂集落实验检测细胞恶性程度,用Transwell实验检测细胞侵袭转移能力。以观察STAT3调控miR-21对亚砷酸钠慢性处理所致HaCaT细胞恶性程度和侵袭转移能力的影响。结果一、亚砷酸钠对HaCaT细胞发生EMT的影响结果发现1.0μMNaAsO2慢性处理30代所致恶性转化HaCaT细胞,随处理时间延长(细胞恶性程度增加),上皮细胞标志E-cadherin水平逐渐降低,而间质细胞标志vimentin水平逐渐升高。说明NaAsO2能够引起HaCaT细胞发生EMT。二、亚砷酸钠对HaCaT细胞IL-6水平的影响结果发现1.0 μM NaAsO2慢性处理30代所致恶性转化HaCaT细胞,随处理时间延长(细胞恶性程度增加),IL-6 mRNA水平和分泌水平均显著升高；1.0 μMNaAsO2处理6、12和24 h的HaCaT细胞IL-6 mRNA水平和分泌水平均明显升高,并具有一定的时间-效应关系。说明NaAsO2可上调HaCaT细胞的IL-6水平进而诱导细胞发生炎症反应。三、亚砷酸钠对HaCaT细胞STAT3激活的影响结果发现1.0μM NaAsO2慢性处理30代所致恶性转化HaCaT细胞,随处理时间延长(细胞恶性程度增加),p-STAT3水平明显升高,而STAT3水平基本不变；而1.0μM NaAsO2处理30 min、1、3和6 h的HaCaT细胞p-STAT3水平均也显著升高,并具有一定时间效应关系,但STAT3水平基本不变。说明NaAsO2能引起HaCaT细胞STAT3激活,其可能在NaAsO2诱导的细胞恶性转化中发挥重要作用。四、亚砷酸钠对HaCaT细胞miR-21水平的影响结果发现1.0μMNaAsO2慢性处理30代所致恶性转化HaCaT细胞,随处理时间延长(细胞恶性程度增加),HaCaT细胞miR-21水平逐渐升高；而1.0 ,μMNaAsO2处理6、12和24 h的]HaCaT细胞miR-21水平也显著升高,呈一定的时间-效应关系。说明NaAsO2可上调HaCaT细胞的miR-21水平,其可能在NaAsO2诱导的细胞恶性转化中发挥重要作用五、IL-6在HaCaT细胞中亚砷酸钠所致STAT3激活和miR-21水平升高的作用结果发现1.0μM NaAsO2引起HaCaT田胞p-STAT3水平和miR-21显著升高,STAT3水平基本不变；而anti-IL-6中和抗体可以明显阻滞1.0 μM NaAsO2所致HaCaT细胞p-STAT3和miR-21水平升高。说明anti-IL-6中和抗体能下调NaAsO2所致HaCaT细胞p-STAT3和miR-21水平升高,提示IL-6可能参与了NaAsO2所致HaCaT细胞STAT3激活和miR-21水平升高。六、STAT3在亚砷酸钠所致HaCaT细胞miR-21水平升高中的作用结果发现1.0 μM NaAsO2引起HaCaT细胞p-STAT3和miR-21水平显著升高,STAT3水平基本不变；而：25 nM STAT3 siRNA可阻滞1.0 μM NaAsO2处理所致HaCaT细胞P-STAT3和miR-21水平升高。说明通过siRNA关闭STAT3可阻滞NaAsO2所致HaCaT细胞p-STAT3和miR-21水平升高,提示STAT3在NaAsO2所致HaCaT细胞miR-21水平上升中发挥重要作用。七、STAT3调控miR-21在亚砷酸钠慢性处理所致恶性转化HaCaT细胞发生EMT中的作用结果发现通过siRNA关闭STAT3引起HaCaT-30T细胞p-STAT3和STAT3及miR-21水平降低,且引起HaCaT-30T细胞E-cadherin蛋白水平升高和荧光强度增加及vimentin蛋白水平降低和荧光强度减弱；上调miR-21引起HaCaT-30T细胞miR-21水平升高,并使关闭STAT3所致HaCaT-30T细胞E-cadherin水平和荧光强度回落减弱,而vimentin水平和荧光强度回升、增强。说明关闭STAT3所致HaCaT-30T细胞EMT逆转(即MET)可被上调miR-21所阻滞,这提示激活STAT3而上调miR-21在NaAsO2慢性处理所致恶性转化HaCaT细胞发生EMT过程中具有重要调控作用。八、STAT3调控miR-21对亚砷酸钠慢性处理所致HaCaT细胞恶性程度和侵袭转移能力的影响结果发现由STAT3 siRNA处理HaCaT-30T细胞形成的软琼脂集落数和细胞侵袭转移细胞数均显著低于对照HaCaT-30T细胞；而STAT3 siRNA联合miR-21mimic处理HaCaT-30T细胞的软琼脂集落数和细胞侵袭转移细胞数均显著高于STAT3 siRNA处理HaCaT-30T细胞。说明关闭STAT3引起的HaCaT-30T细胞恶性程度和侵袭转移能力降低可以被上调miR-21所阻滞,这提示激活STAT3而上调miR-21在NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞恶性转化和侵袭转移过程发挥重要调控作用。结论1、NaAsO2慢性处理可诱导HaCaT细胞发生EMT和恶性转化。2、NaAsO2慢性处理可诱导HaCaT细胞发生炎症反应,且促炎因子IL-6参与了NaAsO2所致STAT3激活和miR-21水平升高。3、STAT3调控miR-21在NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞发生EMT和细胞恶性转化中具有重要作用。