围食膜(peritrophic membrane,PM)是大多数昆虫消化道内包裹食物颗粒的非细胞半透性膜状结构,主要由几丁质、粘多糖和蛋白质组成。围食膜作为昆虫防御消化道致病微生物的第一道物理屏障,一方面需要保证结构完整致密,保护中肠上皮细胞、阻止病原物入侵;另一方面又要保持一定的通透性,方便物质流通,以保证昆虫正常的生理活动。围食膜作为害虫防治靶标已在多种昆虫中被研究报道,多种通过破坏围食膜提高杀虫率的增效因子被发现。但围食膜通透性的基础研究仍不全面透彻,影响围食膜通透性的因素及其作用效果、作用机理、破坏程度仍不明确。本研究采用尤斯灌流室(Ussing Chamber)在体外测量围食膜对不同分子量蓝色葡聚糖的透过性、通过环扫电镜观察围食膜表面结构、结合SDS-PAGE凝胶电泳和质谱分析,探究围食膜蛋白与通透性的关系。主要得到以下实验结果:1.围食膜不同部位的通透性不同,从前(中肠前端)至后通透性逐渐降低;家蚕不同发育时期的通透性不同,从3龄至5龄围食膜通透性逐渐降低,在眠期通透性显著升高,眠起后又恢复正常水平。推测在每一龄眠期存在围食膜降解和更替过程,每一龄眠起后,围食膜网状结构更加致密或围食膜层数增多,导致通透性降低。从家蚕5龄蜕皮后开始饥饿处理,围食膜通透性在5龄1 d与正常喂食的对照组无显著差异,说明围食膜形成与取食活动无关,且饥饿48 h内围食膜通透性变化不明显,48 h后即开始升高,96 h与对照组有显著差异,推测是长时间饥饿导致家蚕围食膜成分部分降解所致。2.多种增效因子(荧光增白剂、凝集素、几丁质合成抑制剂、几丁质酶、蛋白酶)对家蚕围食膜的结构和功能有影响,但作用效果或作用程度和其他鳞翅目昆虫表现有不一致性。添食实验中,荧光增白剂FB28对围食膜的破坏最为强烈和迅速,2-4 h围食膜通透性显著增强,4 h时已能透过2000 kDa葡聚糖分子,通过环扫电镜观察到此时围食膜表面不光滑,并出现1.4μm左右的圆形凸起;6 h时围食膜基本消失。凝集素对家蚕围食膜也有一定影响,48 h观察到围食膜依然相对完整,但膜厚度不均,同时电镜观察到“无定型的、球形的电子致密的结构”。灭幼脲添食后,围食膜表面粗糙,但通透性反而降低,对围食膜进行刚果红染色,发现围食膜多层结构异常,层与层之间变疏松、皱褶增多,结合电镜观察围食膜表面结构粗糙,凹凸不平。推测是由于几丁质合成被抑制导致蛋白结合紊乱,层状结构异常,导致物质通过缓慢,从而使通透性降低。3.几丁质酶和蛋白酶都能在短时间内破坏围食膜,导致通透性显著增大,但电镜观察围食膜表面形态发现两者作用效果有所区别,蛋白酶导致围食膜表面粗糙,膜表面蛋白分解形成凸起;几丁质酶分解围食膜几丁质骨架,导致围食膜形成同方向的凹沟和裂缝。4.围食膜上的4类蛋白(能被生理盐水洗脱的蛋白、需温和洗涤剂才能洗脱的蛋白、必须在强变性剂的条件下才能从围食膜上提取的蛋白和以上三种情况下均不能被洗脱的蛋白)中,对围食膜通透性影响最大的提取剂是第三类提取剂(本实验中为尿素)。除蛋白提取剂能影响围食膜通透性外,农药辅助剂中部分乳化剂和分散剂也能够增大围食膜通透性。5.SDS-PAGE和质谱分析表明:荧光增白剂FB28对围食膜蛋白有显著影响,在形态变化最剧烈的时期(添食后2-4 h)高分子量蛋白减少,在17 kD处出现新的条带。恢复正常饮食后该条带消失,高分子量蛋白重新出现,12 h后蛋白基本全部恢复。对该条带的蛋白进行质谱分析,发现与对照组相比新增了与免疫(Apolipophorin-III、Beta-1,3-glucanase)、昆虫抗逆能力(Methuselah-like protein5)和蛋白质结合(60s ribosomal export protein NMD3)等相关的蛋白。6.生理盐水能洗脱围食膜上大量蛋白(至少10条多肽),但对围食膜通透性无显著影响,说明这些蛋白很可能是附着在PM表面的酶类和肠腔残留物。对尿素洗脱下来的蛋白进行质谱分析,发现多是几丁质结合蛋白和膜结合蛋白,这些蛋白影响到围食膜的通透性。