随着进化的进行,脑的结构经历了巨大的变化。从爬行动物的旧皮层到哺乳动物的新皮层,脑的功能实现了由维持简单身体机能到具有鲜明情绪变化的巨大飞跃。哺乳动物大脑新皮层由6层神经元和胶质细胞组成,每层神经元的分子特征、细胞形态和纤维投射位置也不尽相同。在过去的几十年间,技术的进步和研究方法的完善使得我们对神经系统的发育有了一定的认识,但对于哺乳动物新皮层发育的时空调控机制仍不明确。就目前的认识而言,在哺乳动物大脑新皮层的发育过程中,信号分子、转录因子和表观调控发挥着重要作用。在哺乳动物中,经典Wnt(Wnt/β-catenin)信号通路具有极高的进化保守性。经典Wnt信号通路参与胚胎发育的多个过程,在早期胚胎发育过程中,经典Wnt信号通路在神经系统的发育以及新皮层的层次形成中发挥重要作用。Zbed3是锌指Bed domain超家族的成员,其可通过“PPPPSPT”motif与Axin1结合,进而调节β-catenin的水平,参与到经典Wnt信号通路的调节。前期,我们实验室阮祥斌博士通过鼠胚电转技术,证明Zbed3可以参与经典Wnt信号的调节,在小鼠皮层发育过程中,参与大脑皮层层次形成的调控。为了进一步研究Zbed3在小鼠新皮层发育过程中的作用,本课题组自中科院动物所李磊研究员实验室引进Zbed3全身性敲除鼠。Zbed3全敲鼠生长发育正常,未见寿命缩短及行为异常,因此我们进一步分析Zbed3敲除对神经系统的影响。比较Zbed3全敲鼠和对照小鼠全脑核磁共振结果,发现Zbed3全敲鼠未见明显的大脑结构异常。接下来,我们分析Zbed3敲除对神经前体细胞增殖和皮层层次形成的影响。通过EdU掺入实验(30 min),结合神经前体细胞标志物Pax6,我们发现Zbed3敲除不影响E12.5、E14.5和E16.5小鼠神经前体细胞的增殖和干性维持。通过EdU示踪实验(E12.5和E14.5),结合深层皮层标志物Sox5(Ⅴ、Ⅵ层)和浅层皮层标志物Cux1(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ层),分析Zbed3 qPCR敲除对于皮层层次形成及神经元迁移的影响。结果表明,Zbed3敲除鼠和对照小鼠间未见明显差异。为确定Zbed3敲除后是否存在遗传补偿,我们通过qPCR技术,检测Wnt相关基因的mRNA在对照组和Zbed3敲除组中的表达变化。我们发现在Zbed3敲除小鼠中,Axin1和β-catenin的表达发生变化。我们通过Western Blot进一步检测Axin1和β-catenin蛋白,发现在Zbed3敲除鼠中,β-catenin蛋白水平升高。由于磷酸化位点的不同,β-catenin在被磷酸化后存在两个去路:在胞质内被降解和进入胞核参与Wnt相关基因的转录调控。我们进一步检测了几种磷酸化形式的β-catenin,发现被降解的磷酸化 β-catenin(Ser33/37/Thr41)和参与转录激活的磷酸化 β-catenin(Ser552and Ser675)在蛋白水平均有升高。在本论文中,通过Zbed3全敲鼠我们分析了 Zbed3敲除对于新皮层发育的影响。由于电转技术的局限、经典Wnt信号通路cell autonomous的特点,我们并未观察到Zbed3敲除后对小鼠大脑新皮层发育产生的影响。随后我们发现β-catenin在Zbed3敲除鼠中表达升高,这反映了 Zbed3在功能上与β-catenin的相关性,同时也暗示了 Zbed3的功能重要性。