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奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus),属于鲈形目(Perciformes),丽鱼科(Cichlids),口孵非鲫属(Oreochromis)。罗非鱼由于其肉质鲜美且无肌间刺,一直以来广受消费者的喜爱。据FAO统计罗非鱼已经成为世界上第二大养殖鱼类,中国是世界上罗非鱼最大的生产国和出口国。口孵非鲫属中有将近70种,但是只有尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)和奥利亚罗非鱼以及其杂交品种广泛应用于渔业生产。由于罗非鱼生长具有显著的性别二态性,雄鱼比雌鱼生长快,因此在生产上更倾向于生产全雄罗非鱼。传统的全雄罗非鱼生产途径有激素处理和杂交。然而激素处理会造成环境的极大污染,且激素残留造成的食品安全问题也日益突出。杂交育种常用的是尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼进行杂交,由于缺少准确的分子标记只能依靠测交来鉴定亲本基因型,费时费力,成本高昂。目前生产上仅尼罗罗非鱼具有可以准确鉴定其遗传性别的分子标记并广泛应用于生产,对于奥利亚罗非鱼虽然有个别有关性别连锁分子标记的报道,但几乎没有可以广泛应用于生产的分子标记。因此开发奥利亚罗非鱼性别特异分子标记对于生产全雄罗非鱼具有重要的意义。另一方面,奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼作为近缘种,基因组相似度高达95%以上,却拥有完全不同的性染色体和性别决定系统。尼罗罗非鱼性别决定系统为雄性异配的XX/XY型,而奥利亚罗非鱼为雌性异配的ZZ/ZW型。尼罗罗非鱼的性染色体是LG(linkage group)23,在一些品系中也有报道认为其性染色体为LG1。奥利亚罗非鱼在LG3上具有一个的雌性性别决定位点,在LG1上具有一个雄性性别决定位点,且雌性位点上位作用于雄性位点。研究奥利亚罗非鱼性别连锁的分子标记及性别决定基因有助于深入解析丽鱼科鱼类的快速成种及适应性辐射等进化生物学问题。本研究构建了一个奥利亚罗非鱼的家系,为后续研究提供充足的实验材料。通过对F2代群体93条个体和两个亲本利用SLAF测序进一步证实奥利亚罗非鱼的性染色体位于LG3,锁定了性别决定候选区间。结合实验室前期对奥利亚罗非鱼ZZ和WW个体基因组重测序,在性别决定候选区间内部筛选ZZ和WW基因组序列差异较大的结构变异(例如插入、缺失)设计引物进行PCR扩增,筛选出5对与性别连锁的分子标记。通过对236尾F2代个体进行验证,计算吻合率,进一步确定性别决定区间。另外,补充和完善了分子标记辅助育种生产全雄罗非鱼的方案。具体结果如下:1.构建了奥利亚罗非鱼的家系。利用ZZ雄鱼(编号为67958)和ZW雌鱼(编号为67013)两个亲鱼交配,得到F1代个体,并采取了三种繁殖方案获得F2代群体。第一种方案是将ZW雌鱼和经芳香化酶抑制剂Fetrozole处理性逆转的ZW假雄鱼繁殖,得到93尾F2代群体,雌雄比例为3:1,基因型比为1(WW):2(ZW):1(ZZ)的后代,该群体主要用于SLAF测序。第二种是将ZZ雄鱼和ZW雌鱼进行繁殖,得到103尾F2代群体,雌雄比例为1(ZW):1(ZZ),该群体主要用来验证分子标记,构建遗传连锁图谱。第三种组合是将WW超雌鱼与性逆转的ZW假雄鱼繁殖,得到40条后代,全为雌鱼且基因型比例为1(ZW):1(WW),该组合主要目的是构建WW维持系,获得大量的WW后代。2.通过SLAF测序数据锁定性染色体和性别决定区间。利用奥利亚罗非鱼93尾F2代个体及其亲本进行SLAF测序,共得到499.59 Mreads数据,开发得到822,487个SLAF标签,其中多态性标签230,795个。共有以下8种类型:ab×cd,ef×eg,hk×hk,lm×ll,nn×np,aa×bb,ab×cc和cc×ab。对本实验来说,因为亲本的基因型为ZW×ZW,因此选择hk?×?hk多态性标签作为适合群体的有效标签,一共有14,458个。通过对性别决定区间进行QTL定位,将其性别决定区间锁定在LG3b染色体,具体区间为0–7,319,395之间,约7.3Mb。3.筛选性别连锁分子标记。结合本实验室前期对奥利亚罗非鱼ZZ和WW个体基因组重测序的分析结果,在SLAF测序得到的性别决定区间内ZZ和WW基因组序列存在结构差异的位置设计引物,进行PCR扩增验证。从200对引物中筛选得到了5个与性别连锁的分子标记,分别命名Marker1-5。其中Marker-1和Marker-2可以准确区分ZZ,ZW和WW三种基因型,Marker-3、Marker-4和Marker-5可以区分ZZ和ZW,但无法区分ZW和WW两种基因型。将上述分子标记分别在236个个体中进行PCR扩增验证,发现Marker-1和Marker-2与在所有个体中均与性别完全连锁,而Marker-3,4,5均存在基因型和性别表型不一致的情况,Marker-3和Marker-4有一条不吻合,Marker-5有两条不吻合。4.收窄性别决定区间,寻找性别决定候选基因。根据5个与性别连锁分子标记在性别决定区间中的位置关系,以2017年NCBI公布的尼罗罗非鱼基因组为参考,画出分子标记在奥利亚罗非鱼LG3染色体中的位置示意图。性别决定区间位于LG3b上0-3,649,243之间,将性别决定区间收窄至3.6Mb。统计分子标记在103尾F2代个体中与性别的吻合率,利用JoinMap4.0构建遗传连锁图谱。Marker-1和Marker-2与的吻合率为100%,与性别完全吻合。Marker-3与Marker-4的吻合率为99.0%,与性别之间的遗传距离为1cM(厘摩),Marker-5的吻合率为98.0%,与性别之间的遗传距离为2cM。5.完善了分子标记辅助育种生产WW超雌鱼方案。利用筛选得到的可以准确区分ZZ,ZW和WW基因型的分子标记Marker-1和Marker-2,可以获得大量的WW超雌鱼,完善了基因型为WY的遗传全雄罗非鱼分子标记辅助育种具体实施方案。1)通过芳香化酶抑制剂(Fadrozole)处理ZZ(♂)×ZW(♀)后代,分子标记筛选出ZW(♂)雄鱼。2)利用分子标记筛选ZW(♀)×ZW(♂)繁殖后代,可以得到WW(♀)超雌鱼。3)通过WW(♀)×YY(♂)杂交可以得到大量全雄WY奥尼杂交鱼。4)也可利用WW(♀)×ZW(♂)可以建立WW超雌鱼的维持系,获得更多的WW个体用于生产。至此,我们可得利用分子标记辅助育种技术生产所有的杂交基因型的罗非鱼例如ZX、ZY、WX和WY,可用于生产和性染色体转化及进化等方面的研究。综上所述,本研究构建了奥利亚罗非鱼的家系,筛选出了5个性别连锁的分子标记,补充和完善了全雄罗非鱼的分子标记辅助育种生产体系。将奥利亚罗非鱼的性别决定区间收窄至3.6Mb。