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内脏痛是临床上最常见的一种症状,内脏痛敏性疾病如肠易激综合症、间质性膀胱炎和子宫内膜异位症等,不仅发病率极高,且在女性多见。内脏痛性别差异现象近年受到极大关注,人们期待通过对疼痛性别差异现象的研究而推进对疼痛尤其是内脏痛的认识,进而提高临床治疗效果。内脏痛性别差异现象提示雌激素对内脏痛的发生和发展具有重要作用。延髓头端腹内侧区(Rostral ventromedial medulla,RVM)是内源性痛觉下行调制系统的一个重要组成部分,同时也是内源性阿片肽发挥镇痛作用的主要功能区域之一。RVM神经元的神经纤维直接下行投射到脊髓后角,易化或者抑制脊髓后角伤害感受信息的传递。既往的研究提示RVM下行易化和抑制作用的失衡与慢性内脏痛敏的发生和维持相关。本实验室前期的工作发现,向RVM微量注射外源性雌激素可以显著增强结直肠充胀(CRD)所引起的腹肌放电活动(内脏运动反应,VMR),表明雌激素可作用于内源性痛觉下行调制系统而参与内脏痛的调节。芳香化酶是雌激素生物合成过程中的关键酶。以往的研究发现,中枢神经系统的许多部位都表达芳香化酶,能够局部合成雌激素。有证据显示局部合成的雌激素对神经系统的功能发挥着重要的调节作用。我们在前期工作中采用免疫荧光的方法在RVM部位检测到芳香化酶的表达,本课题的目的之一是通过检测芳香化酶表达水平和干预芳香化酶活性的方法,研究RVM局部合成的雌激素在结直肠痛敏的发生和维持中的作用。传统上认为雌激素与核受体ERα和ERβ结合,在蛋白质转录水平调控细胞的功能(基因组效应)。然而,越来越多的文献报道雌激素还通过G蛋白偶联型受体—GPR30发挥快速的非基因组效应。我们在前期工作中通过免疫荧光和Western blot等方法发现RVM部位高表达GPR30,而未检测到ERα和ERβ表达。与微量注射雌激素引起的效应相似,RVM部位微量注射GPR30选择性激动剂G1,也能够显著增强CRD引起的VMR,并提高该部位μ型阿片受体(MOR)磷酸化水平和减弱吗啡在该部位的镇痛效应。这些结果提示,在RVM部位,雌激素通过激活GPR30而发挥对内脏痛的调节作用,其下游的信号通路涉及MOR的磷酸化。本课题的目的之二是通过干预RVM部位GPR30表达和活性的方法,揭示雌激素-GPR30-MOR信号通路在结直肠痛敏的发生和维持的作用。主要实验方法和结果如下:一、RVM局部合成的雌激素参与中枢性结直肠痛敏1.中枢性结直肠痛敏大鼠RVM区域芳香化酶表达显著升高。我们采用三次间歇性腹腔注射环磷酰胺(CPM,50 mg/kg,间隔2天注射一次)的方法建立慢性膀胱炎大鼠模型(CPM大鼠)。在第3次给药后的第10天,观察结直肠充胀引起的腹肌收缩反射(AWR)以评估结直肠痛敏反应。我们发现,CPM大鼠AWR评分显著高于盐水对照组大鼠,并且雌性CPM大鼠AWR评分显著高于雄性CPM大鼠。对膀胱和结直肠组织的HE染色显示,CPM大鼠膀胱组织呈现一定程度的炎症反应,而结直肠组织无明显的病理改变。以上结果表明,CPM诱导的慢性膀胱炎大鼠产生了慢性中枢性结直肠痛敏。采用免疫荧光和Western blot的方法检测RVM区域芳香化酶的表达,我们发现,相比于盐水对照组,CPM大鼠RVM区域芳香化酶的表达显著升高。2.芳香化酶抑制剂可显著减轻CPM诱导的结直肠痛敏反应。在上述大鼠模型,通过预置的导管向小脑延髓池内给予芳香化酶抑制剂Fadrozole(FAD)和Letrozole(LET)以抑制RVM区域雌激素的合成。与小脑延髓池内注射溶剂对照相比,FAD和LET都可以显著地降低CPM大鼠的AWR评分。采用Western blot方法,我们观察到FAD和LET都可显著降低CPM大鼠RVM区域μ型阿片受体(MOR)的磷酸化水平,并增加MOR的表达,但对RVM区域芳香化酶和GPR30的表达没有明显影响。二、RVM区域GPR30在CPM诱导的结直肠痛敏中发挥重要作用1.GPR30-shRNA可预防CPM诱导的结直肠痛敏。与盐水对照组大鼠相比,CPM大鼠RVM区域GPR30表达显著增高。为验证GPR30在结直肠痛敏的发生中的作用,我们预先(第一次注射CPM前一周)向CPM大鼠的RVM区域微量注射携带GPR30-shRNA干扰序列的腺相关病毒(GPR30-shRNA-AAV),并以携带Scrambled核苷酸序列的腺相关病毒(Scr-AAV)为对照。Western blot检测结果显示,GPR30-shRNA-AAV预处理有效地敲低了CPM大鼠RVM区域GPR30表达水平。行为学实验观察到,GPR30-shRNA-AAV预处理的CPM大鼠AWR评分与盐水对照组大鼠相似,明显低于Scr-AAV预处理的CPM大鼠AWR评分。同时,GPR30-shRNA-AAV预处理还显著降低CPM大鼠RVM区域MOR的磷酸化水平及增强MOR的表达。2.GPR30选择性阻断剂显著降低CPM诱导的结直肠痛敏反应。我们进一步观察了GPR30阻断剂G15对CPM诱导的结直肠痛敏反应的影响。自建模前7天,通过渗透压泵向大鼠小脑延髓池持续给予G15,建模后第10天进行AWR评分,同时检测RVM区域MOR和磷酸化MOR表达水平。我们发现,与RVM区域GPR30-shRNA-AAV预处理的效应相似,小脑延髓池G15预处理同样可以显著减弱CPM大鼠结直肠高敏感行为、降低RVM区域MOR的磷酸化水平和增强MOR的表达。综上所述,在课题组前期工作基础上,本课题进一步探讨了RVM区域局部合成的雌激素和G蛋白耦联型雌激素受体GPR30在结直肠痛敏中的作用。我们发现,在环磷酰胺(CPM)诱导的慢性中枢性结直肠痛敏大鼠模型,RVM区域芳香化酶、GPR30和磷酸化MOR表达显著升高;芳香化酶抑制剂能有效地逆转CPM大鼠结直肠痛敏反应,并降低MOR的磷酸化水平和上调MOR的表达;干扰RVM区域GPR30表达或阻断GPR30的功能,都能降低该区域MOR的磷酸化和防止CPM诱导的结直肠痛敏的形成。这些结果表明,RVM局部合成的雌激素在中枢性结直肠痛敏的发生和维持中发挥重要作用;在该部位,雌激素的效应是由GPR30介导的,其下游涉及内源性阿片受体信号通路的抑制。