葡萄(霞多丽)浆果中糖苷酶分布的研究

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β-葡萄糖苷酶是分解和释放葡萄汁和葡萄酒中无香气的香气前体物的关键酶类。本文探索优化了霞多丽浆果中β-葡萄糖苷酶的粗酶液制备方法,还建立了以p-NPG为底物的比色法测定霞多丽浆果中的β-葡萄糖苷酶酶活性检测方法,并且检测了霞多丽葡萄果皮、果肉、果梗和种子中的β-葡萄糖苷酶分布。为从葡萄中提取葡萄糖苷酶和对葡萄酒的香气研究提出一定的理论基础和科学依据,并对葡萄酒的酿造工艺的优化和完善提出科学建议。本试验的主要研究结果如下:1.霞多丽浆果中β-葡萄糖苷酶的酶粗提液制备方法试验探索了霞多丽浆果中的β-葡萄糖苷酶酶粗提液的制备方法。通过对冰浴和液氮研磨破碎葡萄材料,制备酶粗提液比较得出结论,制备粗酶液过程中采用冰浴破碎会使β-葡萄糖苷酶部分或者完全失活,检测不到酶活或者酶活检测结果不准确,而液氮研磨破碎葡萄材料,制备酶粗提液,检测结果稳定准确。本实验采用液氮研磨制备酶粗提液。2.霞多丽浆果中β-葡萄糖苷酶活性分析条件的建立。本实验通过对β-葡萄糖苷酶活性测定方法电化法、荧光法、分光光度法等的比较研究,采用了以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG )为酶反应底物的比色法检测霞多丽浆果中的β-葡萄糖苷酶活性。以霞多丽浆果为材料,对β-葡萄糖苷酶活性分析条件进行的研究结果表明, PVP加入量对酶活性影响较大,当PVP加入量在0~4 %范围里,随着PVP加入量的增大,酶活性呈上升的趋势,当PVP加入量达到4 %时,酶活性变化不再明显,同时酶反应液澄清度不好,实验选择PVP加入量为3 %;缓冲液类型及pH值对酶活性也有较大影响。随着pH值的增大,酶活性均呈现先增后减的趋势,当pH为6.0时酶活性达到最大值。在相同pH条件下,柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液提取和反应的酶活性最大。酶的吸收波长分析结果表明,在波长在400~410 nm范围里β-葡萄糖苷酶的反应生活物对-硝基苯酚能获得最大的光吸收值,试验选择405 nm为试验检测波长。酶促反应以37℃为宜,在此条件下反应120 min内酶活性分析结果最稳定。据此和正交实验分析得出霞多丽浆果中β-葡萄糖苷酶提取测定条件为酶促反应温度为37℃,反应时间为90 min,β-葡萄糖苷酶提取和反应最适缓冲液及pH是柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,pH 6.0,检测波长为405 nm。3.霞多丽浆果不同部位的β-葡萄糖苷酶活性分布。实验采用以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG )为酶反应底物的比色法检测霞多丽浆果不同部位的β-葡萄糖苷酶活性,按照以上所得的活性分析条件检测酶活性。结果显示,得到霞多丽成熟种子的β-葡萄糖苷酶活性高于果皮、果肉,而果皮果肉的活性又高于果梗,其果实不同部位的β-葡萄糖苷酶活性差异极显著,霞多丽浆果中果皮部分β-葡萄糖苷酶活性的99.0 %的置信区间是9.2476(U/gFW)±0.5072,霞多丽浆果果肉部分β-葡萄糖苷酶活性的99.0 %的置信区间是8.6586(U/gFW)±1.3703,霞多丽浆果果梗部分β-葡萄糖苷酶活性的99.0 %的置信区间是2.6035(U/gFW)±0.3489,霞多丽浆果种子部分β-葡萄糖苷酶活性的99.0 %的置信区间是10.6682(U/gFW)±0.3871。
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