青礞石中金属离子对于中医痰证的干预作用及药效物质基础研究

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青礞石(Chloriti Lapis)是临床常用矿物类中药之一,具坠痰下气、平肝镇惊之功效。其药用历史悠久,疗效显著,但其作用机制和药效物质基础尚不明确,相关研究报道较少。青礞石是多种无机元素的集合体,主要含有Si、Fe、Mg、Al、Ca、K、Na 7种元素,尚含有与人生命活动息息相关的Zn、Cu、Co、Cr、Mn、V、Ni、Sr、Sn等微量金属元素。这些金属元素的含量、种类、价态、相互关系以及对相关金属蛋白等大分子的干预作用可能是其防病治病的基础。为了研究青礞石中金属离子对于中医痰证的干预作用及药效物质基础,本论文根据青礞石的功效以及其临床应用经验,选择了慢性阻塞性肺疾病急性加重期(Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)痰热证大鼠作为研究的动物模型,采用药理学、代谢组学、金属元素分析等中药现代研究思路结合液相-质谱联用、电感耦合等离子体-质谱联用、多元统计分析等现代分析手段,对青礞石中金属离子对于中医痰证的干预作用及其作用机制和药效物质基础作全面、深入的研究探讨,同时为矿物药的现代研究提供参考。本论文获得国家自然科学基金青年项目(No.81303178)和江苏省自然科学基金项目(No.BK20130957)共同资助。本论文主要内容及研究结果如下:1 文献研究通过大量国内外相关文献资料的查阅及整理,首先归纳、总结了中西医对痰证的认识及其之间的差异,并从现代科学的角度总结了痰证的实质,发现其主要与血液流变学、氧自由基、能量代谢、机体免疫、神经系统、粘附分子等密切关系,为实验研究提供了理论参考;其次,综述了矿物药在呼吸系统类疾病中的应用,整理了 2015年版《中国药典》(一部)、《中药大辞典》、《中华本草》收载的单位矿物药用于治疗呼吸系统疾病的情况,并比较了此类矿物药主要成分、金属元素组成等特征,为青礞石的作用机制及物质基础研究提供可能的参考。2 药效学研究采用烟熏结合细菌感染再加以风热刺激的复合型方法建立AECOPD痰热证大鼠模型。将建模成功的大鼠平均分为8组:模型组,青礞石药材高、低剂量组,青礞石水煎液高、低剂量组,药渣高、低剂量组,氨茶碱组,未作任何处理的作为空白对照组。按照青礞石临床应用经验(入丸散3-6 g,煎汤10~15 g)折算对应组的给药剂量,灌胃给药15 d后,采集大鼠血清和肺组织样品。采用HE染色病理观察评价各组大鼠肺部病理情况,免疫组化法检测肺组织中NF-κB蛋白表达,酶联免疫吸附法测定血清中CRP、IL-8、TNF-α、LTB4、MMP-9、TIMP-1及肺组织匀浆液中IL-8、TNF-α、ICAM-1、MCP-1的含量。结果显示,与正常组比,模型组大鼠体重显著降低,肺部主要发生间质性肺炎、肺泡壁增厚、炎细胞浸润、多数肺泡出现肺气肿、肺内支气管分支周围有炎细胞浸润等病理改变,肺组织NF-κB蛋白表达量、血清和肺组织匀浆液中CRP、IL-8、TNF-α等炎症因子水平均显著升高(P<0.05)。青礞石药材高剂量、水煎液高剂量、药渣高剂量干预后均能显著的改善模型大鼠肺部病理改变、降低血清及肺中炎症因子含量,促进气道修复,起到良好的药效作用,而三者疗效相近。青礞石干预AECOPD痰热证大鼠的药效学研究为本论文的代谢组学、金属元素分析等研究提供了实验基础,也为青礞石现代药理研究提供了参考。3 代谢组学研究采用UHPLC-QTOF/MS分析技术结合高通量筛选、PLS-DA和OPLS-DA多元统计分析等数据分析手段进行了青礞石对AECOPD大鼠干预的血浆、尿液及肺组织代谢组学研究。青礞石给药剂量为药效学研究中疗效显著的青礞石药材高剂量。主要研究对象为血浆、尿液及肺组织中m/z为100-1000的所有内源性小分子代谢物。结果表明,正常组和模型组的血浆、尿液和肺组织代谢轮廓均明显分离,说明本方法复制的AECOPD模型大鼠的机体代谢发生了明显的紊乱;给药Od、5 d、10 d、15 d时各组大鼠血浆和尿液代谢轮廓分析结果表明,青礞石干预后AECOPD大鼠代谢轮廓逐渐接近于正常组,以第15 d时效果最佳,说明青礞石可显著改善AECOPD大鼠机体代谢紊乱,并表现出一定的时--效关系;采用OPLS-DA法分析了给药15 d时正常组和模型组血浆、尿液和肺组织的代谢组学数据,共筛选并鉴定出30种差异代谢物,其中血浆中L-肉毒碱、L-缬氨酸、L-棕榈酰肉碱、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(18:2(9Z,12Z))、LysoPC(18:1(9Z))、L-谷氨酰胺、牛磺酸、甘氨胆酸、胆酸、花生四烯酸、二十二碳六稀酸共12种,尿液中植物鞘氨醇、7-甲基鸟嘌呤、3-羟基-2-氨基苯甲酸、肌酸、肌酸酐、癸二酸、尿酸、牛磺酸、反丁烯二酸共9种,肺组织中植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇、十四酰肉碱、棕榈酰肉碱、反油肉碱、LysoPC(18:2(9Z,12Z))、LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1(9Z))、LysoPC(18:0)、硬脂酸、LysoPC(15:0)、花生四烯酸、二十二碳五烯酸、亚油酸、棕榈酸15种,主要涉及甘油磷酸脂代谢,花生四烯酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,鞘脂类代谢,脂质代谢,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,初级胆汁酸代谢,亚油酸代谢等二十多条代谢通路,其中影响最为重要有6条代谢通路:牛磺酸和亚牛磺酸代谢,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成,花生四烯酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,亚油酸代谢和鞘脂类代谢。青礞石干预后,对血浆、尿液和肺组织中L-缬氨酸、L-棕榈酰肉碱、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(18:2(9Z,12Z))、LysoPC(18:1(9Z))、牛磺酸、甘氨胆酸、花生四烯酸、植物鞘氨醇、7-甲基鸟嘌呤、3-羟基-2-氨基苯甲酸、肌酸酐、癸二酸、反丁烯二酸、十四酰肉碱、反油肉碱、LysoPC(16:0)、硬脂酸、LysoPC(15:0)、棕榈酸共20种差异代谢物具有显著积极的调节作用,根据以上差异代谢及其相关通路分析,从代谢组学角度解释青礞石的作用机制可能为:通过对牛磺酸和亚牛磺酸代谢,鞘脂类代谢,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成,花生四烯酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,脂肪酸代谢,初级胆汁酸代谢,甘油磷酸脂代谢等多条代谢途径进行调节,而达到改善机体免疫功能、抑制炎症反应、增强营养吸收、促进细胞生长及信号传导等作用,最终起到良好的干预效果。4 金属元素分析——物质基础研究采用ICP-OES和ICP-MS分析技术分别同时测定了青礞石干预后各组血浆和肺组织中多种常量及微量金属元素的含量,本部分实验研究的血浆和肺组织样品来源于代谢组学实验。同时采用OPLS-DA和层次聚类分析研究大鼠血浆和肺组织中金属元素的变化情况。结果表明,与正常组、模型组和青礞石组大鼠血浆和肺组织中金属元素得分图彼此分离,说明三组间金属元素均发生了变化。对各组间各个元素的含量做方差分析,找出差异变化的金属元素,与正常组比较,AECOPD大鼠血浆中Fe、V、Cu、Zn、Sr、Sn、Ba7种元素含量以及Cu/Zn值显著降低,Ti、Ni和Pb含量显著上升(P<0.05);肺组织中Be、Cr、Co、Zn、Sr、Ba、Pb含量显著降低,Fe、Al和Cd显著上升(P<0.05)。青礞石干预后,可使大鼠血浆中Fe、Ti、V、Cu、Zn、Cu/Zn、Sn、Pb以及肺组织中Al的含量显著恢复正常水平,同时,还能显著升高血浆Mn、Co的含量,显著降低肺组织中Ti、Mg含量。因此,可推测青礞石的作用机制可能与其能够补充机体必需微量金属元素、调节过剩元素等有关,青礞石中Fe、Ti、V、Cu、Zn、Sn、Mn、Co、Mg、Al等直接或间接有益元素的组成、价态及相互关系可能是其效应物质基础。
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