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目的应用同位素标记相对和绝对定量蛋白组学技术（iTRAQ）鉴定和筛选与巨大肝细胞癌根治术后近期复发转移相关的差异蛋白，试图找到术后近期复发转移预测新指标和治疗新靶点。方法1.回顾性分析166例巨大肝细胞癌患者的临床病理资料，根据术后近期复发转移时间，分为术后6个月内复发转移组和6～12个月内复发转移组，应用Logistic回归模型分不同时间段对临床病理因素进行单因素和多因素分析，并建立术后近期复发转移概率预测数学模型。2.蛋白组学实验：应用巨大肝细胞癌手术切除组织标本作为实验对象，根据临床随访复发转移与否分为3组（随访时间24个月）：术后6个月内复发转移组（n=20），术后6～12个月内复发转移组（n=20）及未复发转移组；对这些组织标本进行蛋白提取、定量和酶解，应用iTRAQ试剂标记（117标记6个月内复发转移组，119标记6～12个月内复发转移组，121标记未复发转移组）二维液相色谱-串联质谱（2DLC-MS/MS）联用技术进行分析。利用ProteinPilot软件（版本4.2）对MS/MS肽段进行分析，在Intemational Swissprot（20111015，human）数据库中鉴定蛋白质并定量。鉴定蛋白的比值117:121或119:121大于2倍或小于0.5倍（P<0.05）认为二者之间存在表达差异。应用MetaCore（GeneGo公司）软件对差异表达蛋白进行GO分析，包括亚细胞定位、分子功能和生物学过程。应用IPA （Ingenuity Pathway Analysis）软件分析差异表达蛋白参与的信号通路和蛋白间相互作用的网络。3.应用蛋白组学实验部分的组织标本和分组标准，采用免疫印迹（WesternBlot）、免疫组化和实时荧光定量PCR（Q-PCR）技术从蛋白和mRNA水平检测差异蛋白Galectin-4、S100A12和Alpha-methylacyl-CoAracemase（AMACR）表达情况，验证质谱的准确性。4.采用构建组织芯片结合免疫组化方法检测感兴趣的目标蛋白Galectin-4在73例巨大肝癌术后1年内复发转移与73例未复发转移的癌组织及配对的癌旁组织和10例正常肝组织中的表达情况，并探讨Galectin-4蛋白表达与各临床病理参数及与复发转移的关系。结果1.术后6个月内复发转移率为36.7%（61/166），术后612个月内复发转移率为27.1%（45/166）；Logistic单因素分析提示术前血清AFP值≥1210ng/ml（X4）、肿瘤包膜（X7）、镜下脉管癌栓(X10)、术后癌细胞病理分级(X11)与术后6个月内复发转移有关，术前血清AFP值≥1210ng/ml（X4）和镜下脉管癌栓(X10)与术后6～12个月复发转移有关；多因素分析提示，术后6个月内复发转移的独立危险因素为术前血清AFP值≥1210ng/ml（X4）、肿瘤有包膜（X7）和镜下脉管癌栓(X10)；术后6～12个月内复发转移的独立危险因素为术前血清AFP值≥1210ng/ml（X4）和镜下脉管癌栓(X10)；术后6个月内复发转移概率的预测方程为P=Y/（1+Y），Y=EXP(-0.852+0.753X4-1.273X7+2.524X10)；术后6～12个月复发转移概率的预测方程为P=Y/（1+Y），Y=EXP(-0.804-0.897X4+0.923X10)。2.利用ProteinPilot软件（版本4.2）对MS/MS肽段进行分析，并在Intemational Swissprot（20111015，human）数据库中搜索，共鉴定出1407种蛋白；基于筛选差异表达蛋白的条件，共筛选出了87个差异表达蛋白；与未复发转移组比较，6个月内复发转移组差异表达蛋白有46个，其中15个蛋白表达上调，31个蛋白表达下调，6～12月内复发转移组差异表达蛋白有49个，其中33个蛋白表达上调，16个蛋白表达下调；6个月内复发转移组、6～12月内复发转移组共同的差异表达蛋白有8个，分别是Galectin-4、Lactotransferrin、Eukaryotictranslation initiation factor3subunit B、Biliverdin reductase A、60kDa SS-A/Roribonucleoprotein、Apolipoprotein A-II、Protein S100A12和Alpha-methylacyl-CoAracemase（AMACR）。3.87个差异表达蛋白生物信息学分析，发现大部分定位细胞质，分子功能主要是蛋白结合，生物学过程主要体现在代谢和调控。差异蛋白富集度最高的生物通路是EIF2信号通路，发现差异蛋白富集度最高的蛋白网络是以ERK1/2为核心的调控网络，共有14个差异表达蛋白参与。4.部分差异表达蛋白验证结果显示，与未复发转移癌组织比较，Galectin-4蛋白和相应的mRNA表达在6个月内复发转移癌组织、6～12月内复发转移癌组织中均下调，与蛋白组学结果一致；S100A12和AMACR蛋白与相应的mRNA表达在6个月内复发转移组表达下调，6～12月内复发转移组表达上调，与蛋白组学结果一致。5. Galectin-4mRNA的表达在巨大肝癌组织中表达上调，在癌旁和正常肝组织中表达均下调，各组间差异具有统计学意义（P<0.05）；扩大临床组织样本量采用组织芯片结合免疫组化的方法检测Galectin-4在巨大肝癌中表达情况，结果显示Galectin-4在巨大肝癌组织中阳性表达率为39.0%（57/146），明显低于癌旁组织71.9%（105/146）和正常肝组织80%（8/10），差异具有统计学意义（P均<0.05）；Galectin-4在12个月内复发转移组阳性表达率为19.1%（14/73），明显低于未复发转移组58.9%（43/73），两组间比较差异有统计学意义（P=0.000）；Galectin-4蛋白阴性表达与性别、年龄、有无合并肝硬化、是否合并乙肝病毒感染、肿瘤包膜、癌细胞病理分化无关，而与术前血清AFP值和镜下脉管癌栓有关（P均<0.05）；Kaplan-Meier生存曲线分析显示Galectin-4阴性表达组3年生存率24.0%低于阳性表达组34.8%（χ2=6.589，P=0.010）；Galectin-4阴性表达组1年无瘤生存率53.1%明显低于阳性表达组83.6%（χ2=5.836，P=0.016）。结论1.巨大肝细胞癌术后12个月复发转移率高；术前血清AFP值、肿瘤包膜、微血管侵犯是巨大肝细胞癌根治术后近期复发转移的危险因素。2.巨大肝细胞癌术后6个月内复发转移和6～12月内复发转移的影响因素不同，复发转移概率预测的数学模型不同。3.经验证确认的差异表达蛋白Galectin-4、S100A12、AMACR有望成为巨大肝细胞癌术后近期复发转移潜在的预警蛋白，其分子机制需进一步研究。4. Galectin-4蛋白在巨大肝癌组织中表达下调；Galectin-4表达与术后近期复发转移有关，Galectin-4低表达提示3年生存率和1年无瘤生存率低，可为巨大肝癌预后判断提供有效依据。