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研究背景:现代医学的进步与科技发展,在给我们带来医学治疗的新手段(如器官移植、肿瘤的放化疗、免疫抑制剂的应用增加等)的同时,也引起了一系列的不良事件的发生,而受害者往往也主要是这些免疫缺陷患者。其中,构成对免疫缺陷宿主威胁最大的3种机会性致病真菌,分别为:烟曲霉、白念珠菌和新生隐球菌。而在这3种机会性致病真菌中,白念珠菌又是最为常见的机会性致病菌,其主要分布于多种组织器官的机会性致病菌,包括口腔、胃肠道、阴道黏膜和皮肤表面等。白念珠菌细胞壁在其致病感染和免疫的过程中具有非常重要的作用。白念珠菌细胞壁的主要成分为多糖,其中含量最多的为葡聚糖。白念珠菌细胞壁的葡聚糖可以通过树突状细胞的表面的受体来诱导宿主机体的固有免疫和适应性免疫。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是联系固有免疫和适应性免疫之间的枢纽,负责感受和监测外界环境,启动宿主免疫反应并指导适当的抗病原体适应性免疫反应的进行。树突状细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs),包括Toll-样受体、C-型凝集素受体,它们能够直接识别并结合微生物上高度保守的分子结构(如白念珠菌细胞壁上的葡聚糖等),进而发挥免疫作用。例如,C-型凝集素受体如Dectin-1通过识别真菌表面的β-葡聚糖,进而识别多种真菌的感染,包括念珠菌、隐球菌、曲霉菌,进而参与细胞内的信号转导。机体通过识别白念珠菌细胞壁及其代谢产物进行不同的免疫反应应答,由于T细胞在免疫应答中处于核心地位,而DC又是目前已知的唯一可以活化的初始辅助性T细胞的专职抗原提呈细胞,因此,研究DC对白念珠菌的抗感染免疫反应就显得尤为重要。因此本研究初步探讨白念珠菌壁中的成分(β(1-3)-葡聚糖)对小鼠树突状细胞免疫应答的机制。 材料与方法:细胞:小鼠树突状细胞DC2.4细胞系;菌株:白念珠菌(ATCC11006)。材料与方法:1.细胞培养:1640培养基、胎牛血清、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、PBS缓冲液等。2.RNA提取及测定:Trizol裂解液、氯仿、异丙醇、RNAase-free水、ddH2O等。3.总蛋白提取及测定:RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA试剂盒等。4.RT-PCR: GAPDH引物、反转录试剂盒、qPCR试剂盒等。5.Western blot:兔抗小鼠GAPDH抗体、兔抗小鼠IL-2、6、8抗体、兔抗小鼠ERK、p-ERK抗体、兔抗小鼠caspase8抗体、兔抗小鼠CDK2抗体、兔抗小鼠cyclin-A抗体、山羊抗兔IgG、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、10×TBST、甘氨酸、Trizma base、SDS等。6.流式细胞术:PBS缓冲液、无水乙醇、PI试剂盒、FITC试剂盒。 结果:在β(1-3)-葡聚糖的作用下,DC2.4细胞内的促炎因子IL-2、IL-6、IL-8的mRNA表达量增加,且在一定的浓度范围内,随着β(1-3)-葡聚糖浓度的增加IL-2、IL-6、IL-8的mRNA表达量也增加,具有浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。且用Western blot的方法检测在β(1-3)-葡聚糖的作用下DC2.4细胞内的IL-2、IL-6、IL-8的蛋白表达水平与mRNA的表达水平结果一致。在β(1-3)-葡聚糖的作用下,细胞S期增加,促进细胞周期进程,且在一定范围内随着β(1-3)-葡聚糖浓度的增加,细胞S期增加,具有浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。且加入ERK信号通路抑制剂PD98059,发现其可以逆转细胞因加入白念珠菌β(1-3)-葡聚糖而引起的S期细胞的增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。用Western blot的方法检测在β(1-3)-葡聚糖和PD98059的作用下DC2.4细胞内ERK信号通路关键蛋白及其下游周期相关蛋白因子的表达也发生相应的变化。在β(1-3)-葡聚糖的作用下,DC2.4细胞的凋亡数量明显减少,且在一定范围内随着β(1-3)-葡聚糖浓度的增加,细胞凋亡减少,具有浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。且加入ERK信号通路抑制剂PD98059,发现其可以逆转细胞因加入白念珠菌β(1-3)-葡聚糖而引起的抑制细胞凋亡,差异均有统计学意义(P<0.05)。用Western blot的方法检测在β(1-3)-葡聚糖和PD98059的作用下DC2.4细胞内ERK信号通路关键蛋白及其下游凋亡相关蛋白因子的表达也发生相应的变化。 结论:白念珠菌细胞壁中β(1-3)-葡聚糖可促进DC2.4细胞炎症因子IL-2、IL-6、IL-8的表达。白念珠菌细胞壁中β(1-3)-葡聚糖可明显促进DC2.4细胞的增殖抑制DC2.4细胞的凋亡,且在一定浓度范围内呈浓度依赖性。ERK信号通路参与上述后两个过程。