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目的：探讨BMMC对布鲁菌的识别机制及应答效应以及Wbo A基因在诱导机体免疫应答中所发挥的作用,为研发以Wbo A-S2株为靶抗原的新型布鲁菌疫苗和布鲁菌病的防治提供实验依据和研究新思路。方法：1.采用IL-3和SCF体外诱导的方法制备BMMC;根据BMMC培养状态及甲苯胺蓝染色对BMMC进行鉴定;2.分别用布鲁菌Wbo A-S2株和S2株按感染复数(MOI)100:1负载BMMC,并以正常BMMC为对照,负载15min,30min,45min,60min后分别进行甲苯胺蓝染色和瑞氏-吉姆萨染色,观察负载不同菌种后的不同时间点BMMC的形态学变化,以观察布鲁菌对BMMC的活化效应及Wbo A基因产物在活化肥大细胞中的作用;3.以FITC标记的布鲁菌WboA-S2株、S2株负载BMMC后激光共聚焦显微镜观察BMMC对布鲁菌Wbo A-S2株和S2株的摄取状态;4.分别用布鲁菌WboA-S2株和S2株按感染复数(MOI)100:1负载BMMC,并以正常BMMC为对照,负载3h,6h,12h,24h后用ELISA法检测上清中TNF-α,IFN-γ,组胺,IL-1,IL-6,IL-12的含量,以观察负载布鲁菌Wbo AS2株和S2株后BMMC释放生物活性介质的情况;5.RT-PCR法检测正常BMMC的TLR2、4、8与9 m RNA的表达;6.分别用布鲁菌Wbo A-S2株和S2株按感染复数(MOI)100:1负载BMMC,并以正常BMMC为对照,负载12h,24h后收集细胞,采用RT-PCR法观察BMMC载菌后不同时间点TLR2,TLR4,TLR8和TLR9 m RNA表达的变化;7.采用流式细胞术检测BMMC负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后12h TLR4和TLR8蛋白的表达。结果：1.负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后BMMC的形态学变化(1)甲苯胺蓝染色后光学显微镜下观察:正常BMMC内有很多颗粒;负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后15min,两组BMMC即发生明显的脱颗粒;随着负载时间的延长,BMMC内的颗粒逐渐减少,至负载后60min,BMMC胞质内几乎无颗粒存在,且Wbo A-S2株负载组较S2株负载组脱颗粒更明显。(2)瑞氏-吉姆萨染色后光学显微镜下观察:负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后15min,两组BMMC体积均开始增大;负载后30min,BMMC胞膜内陷,细胞质中开始出现空泡,但两组胞膜均完整;负载后45min,BMMC胞质中空泡明显增多增大,胞膜出现泡沫化;负载后60min,BMMC胞质中几乎全是空泡,Wbo A-S2株负载组的BMMC细胞膜较S2株负载组较完整。(3)激光共聚焦检测结果:BMMC负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株1h时,Wbo AS2株和S2株均位于BMMC胞膜上,说明布鲁菌并未被摄入到肥大细胞内,而是粘附在细胞膜表面。2.布鲁菌WboA-S2株和S2株对BMMC的激活作用(1)BMMC负载布鲁菌WboA-S2株和S2株后,两组在各个时间点上清中TNF-α的含量均明显高于正常对照组(P<0.05),但S2株负载组在各个时间点之间TNF-α的含量无明显差异,而Wbo A-S2株负载组随着时间的延长,TNF-α的含量逐渐增加,至12h时达到高峰,24h时开始下降,且Wbo A-S2株负载组在各个时间点上清中TNF-α的含量均明显高于S2株负载组;(2)BMMC负载布鲁菌WboA-S2株和S2株后,S2株负载组上清中IL-6的含量与正常对照组相比无显著差异(P>0.05),而Wbo A-S2株负载组显著高于同一时间点S2株负载组以及正常对照组(P<0.01),且随着负载时间的延长,IL-6的含量有增加趋势,至12h达高峰,24h时又开始下降。(3)BMMC负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后,两组在各个时间点上清中组胺的含量均明显高于正常对照组(P<0.05),随着负载时间的延长,S2株负载组上清中组胺的含量呈增加趋势,而Wbo A-S2株负载组各个时间点之间无明显变化。而且,负载24h时,S2株负载组明显高于Wbo A-S2株负载组(P<0.05)。(4)在布鲁菌Wbo A-S2株负载组和S2株负载组各个时间点的上清中均未检测到IFN-γ,IL-1,IL-12。3.BMMC对布鲁菌Wbo A-S2株和S2株的识别机制(1)正常小鼠BMMC在m RNA水平表达TLR2,4和8,不表达TLR9。(2)负载布鲁菌WboA-S2株和S2株的BMMC在12h,24h TLR4都有明显变化,两组TLR4在负载12h时的表达均明显高于正常对照组,但Wbo A-S2株负载组的BMMC TLR4 m RNA的表达明显高于S2株负载组,24h时两组表达均明显减少。(3)S2株负载组在12h时TLR8 m RNA的表达有上升趋势,但与正常对照组相比无明显变化,而Wbo A-S2株负载组的TLR8表达明显高于正常对照组,24h时两组TLR8的表达均减少。(4)负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株的BMMC,在12h,24h TLR2的表达量均没有明显变化。(5)正常小鼠BMMC在蛋白水平表达TLR4和TLR8。(6)Wbo A-S2株负载组和S2株负载组12h TLR4蛋白的表达均显著高于正常对照组;S2株负载组在12h TLR8蛋白的表达与正常对照组相比无统计学意义,而Wbo A-S2株负载组12h TLR8蛋白的表达显著高于正常对照组。结论：1.负载布鲁菌WboA-S2株和S2株后均可使BMMC活化;2.布鲁菌WboA-S2株和S2株主要粘附于BMMC细胞膜表面,而未被摄入到细胞内;3.布鲁菌WboA-S2株和S2株均可快速诱导BMMC释放大量的细胞因子,且Wbo A-S2株激活BMMC的能力强于S2株。4.TLR4在BMMC识别布鲁菌中发挥重要的作用。