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肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)发生的中心事件是由于肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)激活,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)生成过多、降解相对不足,在肝内大量沉积。在HF恢复期,HSC凋亡明显增多,一方面消除了ECM的来源,另一方面也解除了金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的抑制作用,从而促进胞外基质的降解。因此,诱导活化HSC凋亡可使HF发生逆转。双环醇是中国医学科学院药物研究所研制的抗肝炎新药,其化学名为6-甲氧羧基-15-羟甲基-2,3,2,3-双亚甲二氧基4,4-二甲氧基联苯。研究表明双环醇对各种实验性急、慢性肝损伤均有保护作用;临床上治疗慢性乙型、丙型肝炎已取得较好的效果。有研究显示双环醇可以使肝纤维化大鼠的前胶原肽(PIIIP)水平下降;同时研究发现临床上双环醇对慢性乙型肝炎的肝纤维化有效。推测双环醇可能通过增加HSCs的凋亡,从而达到治疗肝纤维化的作用。目的:本实验通过设计不同浓度的双环醇干预体外培养的肝星状细胞,研究它对激活的肝星状细胞增殖与凋亡的影响;对肝星状细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential , MMP)的影响;对细胞凋亡酶Caspase3活性的影响。方法:体外培养大鼠肝星状细胞,进行以下分组:①对照组;②0.01mmol/l双环醇组;③0.1mmol/l双环醇组;④0.5mmol/l双环醇组;⑤不含DMSO组;⑥AC-DEVD-CHO组。应用MTT法、3H-TdR掺入法检测双环醇对激活肝星状细胞增殖的影响。用Hoechst3325染色荧光显微镜下检测细胞凋亡率;JC-1染色激光共聚焦显微镜检测HSCs线粒体膜电位,流式细胞仪检测HSCs线粒体膜电位;应用酶标仪检测Caspase3的酶活性。结果:①不同浓度的双环醇对HSCs增殖的影响:MTT法检测显示,对照组与不含DMSO组A490值无差别,说明0.02%DMSO对HSCs增殖没有影响(P>0.05);对照组的A490值总体均数与不同浓度的双环醇组的差异有统计学意义(P<0.05), 0.1mM及0.5mM双环醇组最低,说明双环醇对活化的肝星状细胞增殖有抑制作用,抑制作用与药物浓度有关,浓度越高,双环醇的抑制作用最强。-TdR掺入法检测同样显示,0.1mM及0.5mM双环醇组低于对照组,差别有统计学意义(P<0.05),进一步说明双环醇对活化肝星状细胞增殖有抑制作用,药物浓度越高作用越强,0.5mM组抑制增殖作用最强。②0.5mM双环醇干预HSCs不同时间对增殖的影响:MTT法检测显示,各组间抑制率总体均数差异有统计学意义(P<0.05),抑制率与干预时间有相关性,12h后开始抑制HSCs增殖,24h及36h到高峰,48h后抑制率有所下降。③不同浓度的双环醇对HSCs的细胞凋亡的影响:Hoechest3325染色荧光显微镜下检测显示,双环醇干预HSCs后,细胞核浓缩、出现凋亡小体;干预细胞24h后,对照组、DMSO组及0.01mM组组间的细胞凋亡率无差别(P>0.05),0.5mM组凋亡率最高,与对照组、0.1mM组的差异有统计学意义(P<0.05),说明双环醇的浓度对活化的肝星状细胞凋亡率有影响,浓度越高则凋亡率越高;0.5mmol/l的双环醇促进活化的肝星状细胞凋亡作用最强。④0.5mM双环醇干预HSCs不同时间对凋亡率的影响:双环醇干预HSCs8h的凋亡率与干预前凋亡率无差别(P>0.05),作用细胞24h和作用32h后细胞凋亡达到最高值,凋亡率总体差异有意义(P<0.05),说明凋亡率与双环醇作用时间相关,时间长,凋亡率高,24h-32h达到最高。⑤0.5mM双环醇对HSCs线粒体膜电位的影响:JC-1试剂盒激光共聚焦扫描显微镜法检测线粒体膜电位, 8h组、16h组与阳性对照组的膜电位无差别(P>0.05),均低于阴性对照组,线粒体膜电位差异有意义(P<0.05),24小时后线粒体膜电位较16h有所回升(P<0.05),说明双环醇可降低活化的肝星状细胞的线粒体膜电位,且与双环醇作用时间有相关性,在8h、16h作用最强。JC-1试剂盒流式细胞仪法检测线粒体膜电位,0.5mM双环醇组与对照组在8h、16h的线粒体膜电位均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),说明双环醇可降低肝星状细胞线粒体膜电位;双环醇干预8h至16h线粒体膜电位较前下降,差异有统计学意义(P<0.05),说明双环醇降低活化的肝星状细胞的线粒体膜电位与时间相关,8h-16h线粒体膜电位最低。⑥Caspase3活性检测显示:0.5mm0l/l的双环醇、0.1mmol/l的双环醇作用活化的肝星状细胞24h后,较对照组Casepase3的活性(1.170±0.123)增高到(2.327±0.179)及(21.643±0.055),Caspase3活性差异有统计学意义(P<0.05 ),说明双环醇对Casepase3活性有影响,与药物浓度有关,0.5mM组的Caspase3的活性最高,0.5mM的双环醇可明显增高Caspase3的活性,而Ac-EDVE-CHO可抑制双环醇增高Caspase3的活性的作用。结论:①体外细胞培养研究表明,双环醇可抑制活化的HSCs的增殖,最有效浓度为0.5mmol/l,在24h-36h对活化的HSCs增殖抑制作用最强。②双环醇可促进活化的HSCs凋亡,浓度为0.5mmol/l作用最强,促凋亡作用随时间延长而加强,在24h-32h作用最强。③双环醇作用于活化的HSCs,可使其线粒体膜电位下降,8h-16h时最明显。④双环醇作用于HSCs,可使Caspase3的活性增强。