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当前,组织工程学的突破进展为研发具有应用价值的骨修复材料赋予了极大启示,而多样化的骨替代材料在系列研究中亦表现出极高的潜在价值,但在应用中往往并不具备实际意义,即其修复能力仍难达到临床需求。从表象上来讲,主要归因于材料本身(如金属、多聚物、生物陶瓷)特性单一,不足以提供骨传导和骨诱导双重信号。然而,本课题组认为：只有充分认识到材料-组织整合过程中的分子机制和细胞作用,才能从根本上解决如上科学问题。骨整合(osteointegration)信号传递到材料-组织界面有两个关键因素：1.要有足够数量的细胞与生物分子充分作用以启动胞内信号；2.生物信号的活性／强度必须高于细胞活性的刺激阂值。从这一要求出发,本课题旨在通过双嗜性分子重组纤维连接蛋白／钙粘附蛋白(recombinant fibronectin/cadherin chimera, rFN/CDH)仿生修饰骨支架材料,构建具有优良生物理化特征的仿生学界面和适宜骨种子细胞粘附、增殖和分化的微环境。通过提高种子细胞在界面的粘附效率和生长信号的强度进而增强组织工程化材料在体内外的骨修复能力,从而有效解决传统组织工程材料粘附效率低和成骨信号弱的问题。方法：1.rFN/CDH融合蛋白的构建设计、基因克隆和蛋白表达纯化以FN和CDH11作为前体分子,生物信息学分析以了解其结构序列与功能基团。采用“同源模建”作为分子模拟策略确定FN和CDH11功能片段的接合方式。常规PCR扩增FNⅢ7-10和CDH11 EC1-2基因片段后应用重叠延伸PCR(Splice-over-extension PCR, SOE-PCR)进行基因拼接。将此融合基因插入原核表达载体pET-22b进而构建重组载体。重组载体转化表达菌株Rsoetta-gami(DE3),优化参数实现rFN/CDH的诱导表达,金属离子层析纯化蛋白。免疫印迹和生物质谱分析确定融合蛋白种属。离心促粘附实验和成骨诱导验证rFN/CDH体外生物活性。2. rFN/CDH-BCP仿生界面的组装策略与表征评价DTBP同双官交联法将rFN/CDH以共价方式接合在双相钙磷陶瓷(Biphasiccalcium phosphate ceramic, BCP)表面构建仿生界面。扫描电镜法(Scanning electro-microscopy, SEM)、X光电子能谱法(X ray photoelectron spectroscopy, XPS)、接触角分析和蛋白吸附实验分别了解仿生修饰对材料表面微观结构、化学元素组成和分布、亲／疏水性、rFN/CDH分布密度的影响,初步评价rFN/CDH-BCP仿生界面的组织相容性。3.体外功能学与机制研究：rFN/CDH-BCP仿生界面对骨种子细胞增殖、粘附和分化的影响以人骨髓间充质干细胞(human Mesenchymal stem cells, hMSCs)为骨种子细胞,采用离心促粘附实验、MTT法和SEM观察rFN/CDH-BCP仿生界面对细胞粘附、增殖、形态的影响。同时,以碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)和骨钙素(osteocalcin,OCN)作为成骨分化的早、晚期指标,分光比色法观察成骨诱导后hMSCs的ALP酶活性,实时荧光定量PCR(real-time RT PCR)和免疫印迹(western blotting)法检测OCN基因和蛋白表达,茜素红染色法鉴定钙结节形成情况。以此综合判断rFN/CDH-BCP仿生界面对hMSCs成骨分化的影响。进一步采用粘附斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)397酪氨酸磷酸化(phosphorylation of Tyrosine 397, pY397)特异性抗体封闭hMSCs表面作用位点,初步探讨FAK pY397与rFN/CDH-BCP介导的细胞粘附和分化间的关系。4.体内功能研究：复合bMSCs的rFN/CDH-BCP组织工程骨的体内成骨效应以兔MSCs(bMSCs)为种子细胞构建rFN/CDH-BCP组织工程化人工骨,将其植入兔腰椎横突5-6间行融合术。影像学手段(X片和CT三维重建)观察骨愈合情况；三点抗弯实验检测腰椎融合部位力学强度；HE、Masson和甲苯胺蓝染色法观察材料-组织间的骨整合状况。结果：1. rFN/CDH融合蛋白的构建设计、基因克隆和蛋白表达纯化确定CDH11 EC1-2-(Ser)3-FNⅢ7-10是适宜融合蛋白构建的接合方式,生物信息学分析提示改良大肠杆菌系统适合融合蛋白优化表达。采用SOE-PCR将0.8kbp的CDH11 EC1-2和1.1kbp的FNⅢ7-10片段成功拼接为1.9kbp的融合基因,双酶切实验和DNA测序证实重组载体构建成功、准确。转化Rosetta-gami(DE3)后于IPTG终浓度0.4mM,重组菌对数生长值0.5-0.6,诱导温度30℃,诱导时间4-6hr的条件下实现对rFN/CDH(75 kDa)的高效、可溶性表达。6xHis标签行镍柱(Ni-NTA)吸附纯化后纯度大于96%。质谱分析确认rFN/CDH种属完全正确,属于一种FN前体分子和一种CDH11前体分子。离心促粘附实验表明rFN/CDH涂层的TCPS表面对成骨细胞株MC3T3-E1的吸附作用明显强于单纯FN和CDH(1.4倍和2.9倍,p<0.05)。成骨诱导实验显示rFN/CDH促进ALP活性升高和OCN基因表达上调,显著优于阳性对照(p<0.05)。2. rFN/CDH-BCP仿生界面的组装策略与表征评价XPS数据显示仿生修饰后BCP表面分别独立出现164.0eV和401.0eV的峰谱,即硫和氮元素的分布,提示界面构建成功、有效。SEM显示BCP表面呈巨孔／微孔不规律分布,且仿生修饰对微结构无明显影响。XPS表明BCP表面分布有C、O、P、Ca四种元素,而仿生修饰后N元素出现,并发生了C元素的价态变化(CC-N)。且元素含量变化为C、N含量增加而P、Ca含量降低(p<0.05)。接触角测定表明θ角显著减小(45°→31°,p<0.05),提示rFN/CDH-BCP界面亲水性增加。蛋白吸附实验提示BCP对rFN/CDH的吸附在一定范围内呈浓度依赖性,且rFN/CDH的饱和工作浓度为5μg/ml,分布密度为1700fmol/cm2。3.体外功能学与机制研究：rFN/CDH-BCP仿生界面对骨种子细胞增殖、粘附和分化的影响hMSCs在rFN/CDH-BCP界面上培养1-9天,其增殖率在前期(1-5天)明显高于阴性和阳性对照组(p<0.01,p<0.05)。SEM发现观察rFN/CDH修饰BCP界面更利于细胞的贴壁生长,表现为hMSCs充分伸展为多边形状或圆盘状,伪足样结构减少。离心粘附实验发现hMSCs在rFN/CDH-BCP表面的粘附数量与生物配基密度表现为正相关,在1500 fmol/cm2的表面密度下是阳性对照的的4.9倍和1.52倍(p<0.05)。此结果提示：rFN/CDH-BCP界面具有极佳的生物相容性,hMSCs在其表面表现出优越的粘附、增殖和生长状态。hMSCs成骨诱导10天后,在rFN/CDH-BCP表面的ALP活性表现最高(约57μmol nitrophenol/min/mg protein, p<0.05)。成骨诱导14天后,在rFN/CDH-BCP表面的OCN基因和蛋白表达水平亦为最高(p<0.05,p<0.05)。成骨诱导21天后,rFN/CDH-BCP表面的细胞间形成的椭圆形橘红色结节在数量和面积上分布最多。此结果表明：仿生修饰界面可更高效地促进hMSCs的成骨分化。。利用FAK pY397特异性抗体来封闭hMSCs表面的信号通路,发现如上指标均受一定程度的抑制,但并非完全性阻断,此结果提示该仿生界面发挥功能不完全依赖于FAK酪氨酸397的磷酸化,尚有其他磷酸化位点或信号分子参与该过程。4.体内功能研究：复合hMSCs的rFN/CDH-BCP组织工程骨的体内成骨效应将bMSCs复合的rFN/CDH-BCP植入兔腰椎5、6横突间成功建立腰椎融合模型,术后3月,采用X片结合CT三维重建的影像学手段定性分析发现rFN/CDH-BCP材料与骨床间隙相延续、模糊不可辨,定量分析显示横突间隙的骨痂填充率以rFN/CDH-BCP为最高(p<0.05)。建立应力-应变曲线分析力学载荷、弯曲强度、弹性模量的数据变化,发现bMSCs复合rFN/CDH-BCP组行腰椎融合后的刚性(0.044±0.0059GPa)显著强于单纯BCP组(0.026±0.0058 GPa,p<0.05),略高于bMSCs复合BCP组(0.041±0.0093),但不及自体髂骨移植组(0.071±0.0119)。组织学水平上,以HE法、Masson法和甲苯胺蓝法染色评价材料-组织间的骨融合状况,发现bMSCs复合rFN/CDH-BCP组植入3月后的组织学表现与自体髂骨移植组相似,表现为融合区域出现成熟度较高的骨小梁连续性、交错性桥接,其在骨量上甚至略高于后者。该成骨能力显著强于bMSCs复合BCP组和单纯BCP植入组(p<0.01)。综合数据提示：rFN/CDH-BCP复合bMSCs后表现出优越的骨传导和骨诱导特性,可显著提高BCP在体内的骨修复和融合能力,具有一定的替代意义。但与自体骨移植标准相比,需进一步提高其力学性能。结论：1.本研究设计、制备的rFN/CDH嵌合式融合蛋白实现了对FN和CDH11功能学的叠加,体外具有良好的促粘和成骨活性。2. rFN/CDH生物配基共价交联生物陶瓷BCP界面后具备优良的粗糙度、微结构、亲水性、化学组成和可控的配基密度等生物理化特征,是一种生物相容性界面。3. rFN/CDH-BCP仿生界面在体外有效增强hMSCs的粘附、增殖效率和生长活力,显著上调了干细胞成骨诱导后ALP、OCN等成骨标志物的表达,明显促进了钙结节形成和基质矿化能力。4.特异性ITG-FAK pY397通路在rFN/CDH-BCP介导的干细胞粘附和分化过程中发挥了重要作用,FAK pY397可能是rFN/CDH-BCP发挥生物效应的调节位点。5. rFN/CDH-BCP用以兔腰5-6横突间融合具有优良的促进骨愈合的能力,具有临床效果的影像学征象、力学整合意义的抗压强度和生物学整合意义的组织学表现,具有一定的替代意义。6. rFN/CDH-BCP具备良好的骨传导和骨诱导特性,是一种有光明应用前景的新型组织工程来源的骨替代材料,可用于非负重部位的骨修复／融合。但与自体骨移植标准相比,需进一步提高其力学性能。