论文部分内容阅读
研究目的:心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床中最常见的持续性心律失常,可导致多种并发症,为家庭及社会带来极大的负担。心房颤动的治疗措施主要包括服用药物治疗与非药物治疗。目前,作为非药物治疗的重要手段,射频消融术在房颤的治疗中发挥着越来越重要的作用,但由于术后较高的复发率,显著影响远期疗效,其中内在自主神经重构在房颤术后复发中的作用不能忽视,而自主神经重构是如何发生的,目前尚不清楚。本研究旨在探究房颤去神经化后内在自主神经重构的发生机制,为术后房颤复发的机制提供一种新的解释。研究方法:1.射频消融犬模型的构建取12只健康成年杂种犬,雌雄不拘,随机分为1月阴性对照组、1月射频消融组、6月阴性对照组及6月射频消融组4组,每组3只犬,阴性对照组仅行开胸处理,射频消融组消融右上、右下神经节。分别饲养1个月及6个月后处死,取距离消融区1cm的心房肌组织进行后续试验。2.高通量测序及验证每组3个样本,共12个样本行高通量测序,寻找差异表达的长链非编码RNAs(long non coding RNAs,lncRNAs)及 mRNAs,并行实时定量 PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)及蛋白质印迹实验(Western Blotting,WB)验证测序结果。3.生物信息学分析对差异表达的lncRNAs行靶基因预测,对差异表达的mRNAs行基因本体论(gene ontology,GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia ofgenes and genomes,KEGG)通路分析,结合共表达分析并且我们前期研究发现犬行射频消融术后GAP43表达量会增加且房颤诱发率在消融1月及6月后增加,筛选出了与内在自主神经重构相关的lncRNA-LncRNA056298并预测其靶基因为GAP43。4.LncRNA056298作用机制预测(1)cis-预测筛选距LncRNA056298上下游10kb以内的转录本,明确LncRNA056298与邻近的转录本是否具有表达相关性。(2)trans-预测以皮尔逊相关系数(pearson correlation coefficient,PCC)>0.85 且P<0.05为标准,筛选与LncRNA056298共表达的mRNAs,并行GO富集分析及KEGG通路分析,预测LncRNA056298的trans-机制。5.细胞实验构建LncRNA056298 Smarter Silencer及阴性对照Smarter,提取犬原代心肌细胞培养,使用lipofectamine2000对原代心肌细胞进行转染,将细胞分为阴性对照组(转染LncRNA056298阴性对照Smarter)及沉默组(转染LncRNA056298 Smarter Silencer),处理48h后提取总RNA,处理72h后提取蛋白质。6.动物分组及慢病毒感染构建LncRNA056298阴性对照及过表达慢病毒,滴度为1×109 TU/ml。取12只健康成年杂种犬,雌雄不拘,随机分为阴性对照慢病毒组(右心房肌内注射LncRNA056298阴性对照慢病毒)及过表达慢病毒组(右心房肌内注射LncRNA056298过表达慢病毒),每组6只犬。于慢病毒注射前及注射慢病毒饲养10天后检测心房有效不应期(atrial effective refractory period,AERP)、房颤诱发率,饲养10天后将实验犬处死取右心房用于后续实验。7.分子生物学指标检测通过 qRT-PCR 及 Western Blotting 分别检测 LncRNA056298 及 GAP43 基因及蛋白水平的变化,采用免疫组化检测CHAT、TH、GAP43及PGP9.5等与内在自主神经重构相关的指标变化。研究结果:1.通过GO富集分析、KEGG通路分析、共表达分析、文献检索并结合前期研究基础对差异表达的转录本综合分析,筛选出LncRNA056298进行下一步研究并预测其靶基因为GAP43。2.在犬原代心肌细胞中,沉默LncRNA056298后,qRT-PCR及Western Blotting示GAP43表达下降,在体感染LncRNA056298过表达慢病毒,通过qRT-PCR及Western Blotting表明GAP43表达水平上升,注射LncRNA056298过表达慢病毒10天后,AERP明显缩短且房颤诱发率升高。免疫组化结果示,过表达慢病毒组内在自主神经重构相关的指标:GAP43、TH、CHAT及PGP9.5表达均增加,以上结果均提示心肌细胞可以通过分泌GAP43导致神经重构的发生。3.LncRNAs对靶基因调控的cis机制是一种基于位置关系的调控机制,发挥cis机制的条件为lncRNAs与其靶基因距离小于10kb且表达具有相关性,本研究中基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)发现LncRNA056298位于GAP43 反义链的非编码序列,qRT-PCR 及 Western Blotting结果表明LncRNA056298及GAP43具有表达相关性,因此推测LncRNA056298可能通过cis-机制影响GAP43的表达。研究结论:LncRNA056298可以通过影响GAP43的表达影响内在自主神经重构的发生,而内在自主神经重构是影响射频消融后房颤复发的一个重要因素,且LncRNA056298可能通过cis-机制影响GAP43的表达。研究意义:本研究从lncRNAs的角度阐释了射频消融术后内在自主神经重构发生的机制,为房颤射频消融术远期预后较差提供了一种新的解释。