山羊干酪性淋巴结炎,是伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）引起的一种传染性疾病,其致病特点是引起山羊体表和体内的脓胞及干酪样脓肿。该病原感染宿主范围广泛,除了易感绵羊和山羊,还可感染其他反刍动物和人。被感染的山羊携带大量病原菌,处理过程不当可对人的饮食卫生和身体健康造成危害,对公共卫生安全具有潜在的威胁。因此,快速准确检测该病原的感染不仅有助于在山羊养殖中控制伪结核棒状杆菌的发生,而且为公共卫生安全提供了保障。目前,诊断伪结核棒状杆菌感染的方法包括病原的分离培养鉴定、PCR检测和血清学诊断等,其中前两种方法通常是出现临床症状后才能进行诊断,在临床上对于早期感染或内脏型感染易发生漏诊。因此,通过血清学检测该病原的早期感染情况具有重要价值。磷脂酶D（PLD）是该致病菌最主要的毒力基因之一,对病原的传播至关重要。常常被作为伪结核棒状杆菌的疫苗和诊断方法的研究靶标。本试验旨在表达出伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白,建立检测伪结核棒状杆菌感染诱发PLD抗体的ELISA方法,在此基础上对重庆地区部分羊场伪结核棒状杆菌感染血清进行流行病学调查和分析,为该病的防控提供科学依据。主要研究内容和结果如下:1.伪结核棒状杆菌磷脂酶D原核表达、生物活性检测及多克隆抗体制备首先以PLD基因全长序列的引物进行扩增并构建p MD19-T-PLD克隆质粒,经双酶切后与p Cold-TF连接构建重组表达载体p Cold-PLD,转入宿主菌BL21中诱导表达。所表达的PLD重组蛋白SDS-PAGE检测后进行纯化,利用与马红球菌培养上清的协同溶血作用检测其生物活性。然后将PLD重组蛋白免疫家兔制备抗PLD高免血清,进行琼脂扩散实验和Western-blot鉴定。结果显示,表达的PLD融合蛋白经SDS-PAGE检测,其分子量约为85.8 k Da（p Cold-TF 52k Da+PLD 33.8 k Da）,纯化的PLD蛋白与马红球菌上清可产生协同溶血反应。琼脂扩散实验显示,PLD重组蛋白与所制备的兔抗PLD高免血清和伪结核棒状杆菌感染山羊的阳性血清产生了沉淀线,效价分别为1:32,1:16。Western-blot结果显示PLD重组蛋白能与山羊伪结核棒状杆菌阳性血清产生单一杂交带。综上表明成功表达了具有良好生物学活性的伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白,而且能与兔抗PLD高免血清和伪结核棒状杆菌阳性血清发生特异性反应。2.检测伪结核棒状杆菌PLD抗体间接ELISA方法的建立以制备的PLD重组蛋白为包被抗原,确定间接ELISA方法的包被抗原浓度和血清稀释度,从而筛选出包被条件、酶标抗体作用时间及其它条件,进而在确定伪结核棒状杆菌阴阳性血清临界值的基础上,对其敏感性、特异性和重复性进行检测评估。结果显示,抗原包被浓度为8μg/m L,血清（一抗）稀释度为1:800,4℃包被12 h为最佳包被条件;5%脱脂奶粉于37℃封闭90 min为最佳封闭条件;一抗最佳孵育时间为30 min;酶标二抗稀释1:8000,37℃孵育30 min为最佳反应条件;显色时间为15min。通过40份阴性血清界定伪结核棒状杆菌感染阴、阳性血清的临界值为0.193。将阳性血清稀释至1:51200时,ELISA检测OD450值仍高于临界值,所建立的ELISA方法与化脓隐秘杆菌、金葡球菌、鲍曼不动氏杆菌感染山羊的阳性血清无交叉反应,板内和板间重复试验的变异系数范围均小于10%。表明所建立的检测伪结核棒状杆菌PLD抗体的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。3.重庆部分地区山羊场伪结核棒状杆菌感染血清流行病学调查应用建立的间接ELISA方法对重庆市11个区县的部分山羊场进行伪结核棒状杆菌感染血清流行病学调查。结果显示,重庆地区山羊伪结核棒状杆菌感染的整体阳性率为47.62%（95%CI=40.30-55.00%）。在所检测样本中,黔江区伪结核棒状杆菌感染阳性率最高,为91.67%（95%CI=61.50-99.80%）,其次为酉阳85%（95%CI=62.10-96.80%）,除荣昌的血清样本中未检测到伪结核棒状杆菌外（0%,95%CI=0-30.80%）,其余区县的伪结核棒状杆菌感染阳性率在5.00-60.00%之间。表明重庆大部分区县均存在伪结核棒状杆菌的感染,各区县之间的感染率差异较大。综合以上,本研究成功获得了生物活性良好的伪结核棒状杆菌PLD重组蛋白,建立了检测伪结核棒状杆菌感染山羊PLD抗体的间接ELISA方法,为该病原感染山羊的血清流行病学调查和免疫抗体水平监测供了技术支持。应用所建立的ELISA方法检测发现,重庆部分区县山羊伪结核棒状杆菌感染率较高（47.63%）,需引起养殖场和畜牧兽医工作者的重视。