反复着床失败患者子宫内膜细胞分泌的细胞外囊泡对胚胎生长和着床的影响及机制探索

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第一部分反复着床失败患者子宫内膜细胞分泌的细胞外囊泡对胚胎生长的影响目的:探究反复着床失败患者子宫内膜细胞分泌的细胞外囊泡是否干扰了胚胎的生长和发育。方法:我们收集了反复着床失败(RIF)患者和正常生育女性(对照组)的子宫内膜,分离子宫内膜细胞,并在体外用激素处理模拟内膜容受状态。子宫内膜细胞的条件培养基,经过超速离心,分离获得细胞外囊泡。RIF组的细胞外囊泡(RIF-EVs)和对照组的细胞外囊泡(FER-EVs)分别用western blotting实验,纳米粒经分析和电镜技术进行鉴定。我们将细胞外囊泡进行荧光标记,与胚胎共培养,探究细胞外囊泡能否被胚胎所摄取。我们将两组细胞外囊泡分别与2细胞的小鼠胚胎在体外共培养75 h,共培养后,分别计算各组胚胎的囊胚形成率以及胚胎孵出率。另外,我们将各处理组中的囊胚吸出,用DAPI染色,计数各个胚胎的卵裂球数目。结果:RIF-EVs和FER-EVs都是双层膜结构的囊泡,直径在100~150 nm,并且均表达细胞外囊泡经典蛋白标志物TSG101,Alix和CD9。两种细胞外囊泡均可以在12h内被胚胎所摄取。共培养后,当细胞外囊泡浓度为5,10,20 μg/mL时,RIF-EVs组的囊胚形成率显著低于相同浓度的FER-EVs组。此外,当细胞外囊泡浓度为10 μg/mL或20 μg/mL时,RIF-EVs组的胚胎孵出率和囊胚的卵裂球数目显著低于相同浓度的FER-EVs 组。结论:RIF-EVs抑制了胚胎的生长和发育。第二部分反复着床失败患者子宫内膜细胞分泌的细胞外囊泡对滋养细胞的影响目的:探究反复着床失败患者子宫内膜细胞分泌的细胞外囊泡是否抑制HTR8/SVneo细胞的增殖,侵袭和迁移能力。方法:我们收集了反复着床失败(RIF)患者和正常生育女性(对照组)的子宫内膜,分离子宫内膜细胞,并在体外用激素处理模拟内膜容受状态。通过超速离心的方法,从细胞的条件培养基中分别获得了 RIF组的细胞外囊泡(RIF-EVs)和对照组的细胞外囊泡(FER-EVs)。我们将细胞外囊泡进行荧光标记,观察细胞外囊泡能否被HTR8/SVneo细胞所摄取。另外,我们将不同浓度的RIF-EVs或FER-EVs加入培养基中,与HTR8/SVneo共培养,并通过CCK-8实验,Transwell侵袭实验和划痕实验,分别探究RIF-EVs对HTR8/SVneo细胞的增殖,侵袭能力,以及迁移的影响。结果:RIF-EVs和FER-EVs均可以在2 h内被HTR8/SVneo细胞所摄取。共培养后,当细胞外囊泡的浓度为20 μg/mL或40 μg/mL时,RIF-EVs组细胞的增殖率显著低于FER-EVs组。当细胞外囊泡的浓度为20 μg/mL时,RIF-EVs组细胞的侵袭能力和迁移能力显著低于FER-EVs组。结论:RIF-EVs显著地抑制了 HTR8/SVneo细胞的增殖活性,并且抑制了细胞的侵袭和迁移能力。RIF患者子宫内膜来源的细胞外囊泡对滋养细胞异常的调节,可能与RIF的发生有关。第三部分反复着床失败患者子宫内膜细胞分泌的细胞外囊泡中miRNA的表达目的:探究反复着床失败(RIF)患者子宫内膜来源的细胞外囊泡中miRNA的表达与生育正常女性的子宫内膜细胞外囊泡相比,是否存在差异。方法:我们收集了 15个RIF患者和9个生育正常女性的子宫内膜,分离子宫内膜细胞,并在体外用激素处理模拟内膜容受状态。通过超速离心,分别获得RIF组的细胞外囊泡(RIF-EVs)和对照组的细胞外囊泡(FER-EVs)。我们用3个RIF-EVs样本和3个FER-EVs样本进行miRNA的测序。剩余的细胞外囊泡每个样本分成两部分,一部分用于qRT-PCR实验,验证差异miRNA的表达。另一部分与HTR8/SVneo细胞共培养,并通过qRT-PCR检测细胞中miRNA的表达。结果:相比FER-EVs,RIF-EVs中有11个差异表达的miRNA。我们通过生物信息学预测了差异miRNA可能影响的细胞通路。此外,通过qRT-PCR实验,我们发现4个miRNA,即 miR-6131,miR-1246,miR-1307-3p 和 miR-218-5p 在 RIF-EVs 中表达显著升高。并且,在与RIF-EVs共培养的HTR8/SVneo细胞中,miR-6131,miR-1307-3p和miR-218-5p表达也显著上调。结论:我们的研究显示,RIF-EVs中miRNA的表达与FER-EVs存在显著差异。此外,差异表达的miRNA可以通过细胞外囊泡传递至滋养细胞中。这些在细胞外囊泡中差异表达的miRNA,可能有助于我们进一步理解RIF的发生。第四部分 miR-6131通过调控PAK2的表达抑制HTR8/SVneo细胞的增殖,迁移和侵袭能力目的:探究miR-6131是否抑制HTR8/SVneo细胞的增殖,迁移,和侵袭能力,并探索调控的分子机制。方法:我们将HTR8/SVneo细胞转染miR-6131mimics或scramble(对照),分别比较转染后两组细胞的增殖活性,迁移,以及细胞的侵袭能力。我们通过生物信息学分析,预测了 miR-6131的靶基因(PAK2),并通过双荧光素酶报告基因实验,qRT-PCR实验,以及western blotting实验,检测miR-6131与PAK2是否存在调控关系。此外,我们通过质粒转染方法上调PAK2表达,探究PAK2过表达是否能逆转miR-6131对HTR8/SVneo细胞的影响。结果:miR-6131过表达可以显著降低HTR8/SVneo细胞的增殖,迁移,以及细胞的侵袭能力。miR-6131可以与PAK2的mRNA在3’UTR区域相结合,从而抑制了 PAK2的蛋白表达。此外,PAK2的过表达可以部分逆转miR-6131对HTR8/SVneo细胞的表型。结论:miR-6131通过靶向调控PAK2表达,抑制HTR8/SVneo细胞的增殖,迁移和侵袭能力。
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