目的用血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)刺激培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(Aortic smooth muscle cell, ASMC)增殖以建立细胞增殖模型,应用Western blot技术、MTT法和钙离子成像技术检测平滑肌细胞(SMC)中的瞬时受体电位通道6(Transient receptor potential channel 6,TRPC6)通道蛋白表达情况、细胞增殖能力变化和细胞内钙离子浓度的变化,以此来评价TRPC6在AngⅡ诱导的大鼠ASMC异常增殖中的作用并初步分析其作用机制。方法1.细胞培养雄性SD大鼠,体重150~200 g,清洁级。颈椎脱臼处死,无菌取出大鼠胸主动脉,放入D-Hanks液中反复冲洗,洗去血污,在缓冲液中剥净外膜,去除内膜,取血管中膜,剪成约1~3 mm2的小组织块接种于直径为35 mm的培养皿内,培养基为DMEM,成分包括20%胎牛血清,L-谷氨酰胺(2 mM),青霉素(100 units/mL),链霉素(100μg/mL)。将培养皿置于37℃,5%CO2培养箱内培养,每隔3天换液。待细胞生长融合约80%时,进行传代。2.形态学和免疫荧光双标染色鉴定取第3~5代细胞,用形态学和免疫反应两种方法鉴定SMC。首先在相差显微镜下观察细胞生长的状态、外形、生长特点、排列方式等,然后选择处于合适的生长状态的细胞,进行消化,接种到盖玻片作细胞爬片,对数生长期时取出,用PBS洗10 min×3次,用预冷的4%多聚甲醛4℃固定20 min,再用5%BSA室温封闭60 min,滴加适当稀释度的一抗,4℃孵育,>14 hrs, PBS洗10 min×3次,滴加适度稀释的荧光标记二抗,避光,37℃孵育1 h。PBS洗后滴加DAPI液(5μg/mL),室温避光显色15 min,荧光显微镜下观察,拍照。3. Western blot分析实验用第3～5代ASMC,当80%的细胞长到融合一起以后,加4℃预冷的PBS(0.01 M,pH 7.2～7.3),洗涤细胞,重复以上操作两次。将PBS弃净后把培养皿置于冰上。加入1 ml预冷的单去污剂裂解液(50 mmol/L Tris·HCl pH 8.0,150 mmol/L NaCl,1%TritonX-100,100μg/mL PMSF)裂解细胞,置冰上裂解5～10 min。用细胞刮把裂解好的细胞刮下来,转移到EP管中,超声震荡后,4℃冷冻离心机以12000 r/min的速度离心15 min,用BCA法检测总蛋白浓度。取样本于10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,蛋白80 V恒压湿转入PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭30 min,孵一抗4°C过夜,0.05% PBS-T洗膜3×10 min,室温共同孵育二抗和HRP-actin抗体1.5 h,0.05% PBS-T洗膜3×10 min,暗室中ECL显色后曝光。4.细胞分组与处理①空白组;②AngⅡ组:加入0.1μmol/L的AngⅡ;③SKF96365+ AngⅡ组:AngⅡ(0.1μmol/L)和不同浓度的SKF96365(10,50,100μmol/L);④flufenamic acid组:不同浓度的flufenamic acid(FFA, 10,20,40μmol/L)。5. MTT法检测选择3～5代ASMC,在37℃用胰蛋白酶消化液消化细胞约1 min,制备细胞悬液,接着以1000 r/min速度离心8 min,弃上清,用含20%胎牛血清的培养液混匀细胞,调细胞密度2.5×104个/mL,接种于96孔板,37℃,5% CO2条件下培养。24 h后换无血清DMEM培养液,继续孵育24 h后换液,分别加各种处理因素,继续培养24 h到72 h。每组设6个复孔,分别于药物作用结束前4 h,每孔加5 mg/mL MTT 20μl,4 h后终止培养,吸弃孔内培养液,每孔加150μl二甲基亚砜,振荡使结晶充分溶解,在酶标仪490 nm波长处测定吸光度。6.钙离子成像钙离子成像技术可监测细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化。首先准备好直径为25 mm的培养皿,把底部的中心挖直径为10mm的孔,用胶粘上一个厚0.1 mm的盖玻片,然后细胞被低浓度接种于这个盖玻片上,细胞至少培养24 h才能做实验。实验时先在37°C用含有4μmol/L的Fura-2/AM的外液孵育ASMC,40min。[Ca2+]i的测量采用一种Ca2+敏感性的荧光染料Fura-2 acetoxymethyl ester ( Fura-2/AM )。结合Ca2+的Fura-2/AM的激发光波长是340 nm,未结合Ca2+的Fura-2/AM的激发光波长是380 nm,发射波长均为510 nm。这样就可以用340 nm和380 nm这两个荧光的比值定量[Ca2+]i的变化。利用钙离子成像分析软件TILLvision软件,可实时检测[Ca2+]i的变化。7.统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计分析比较MTT法检测得到的数据,钙成像数据用Igor Pro软件进行统计分析,两组均数的比较用t检验,组间比较采用单因素方差分析。统计数据以x±s表示,p < 0.05认为差异有显著性。结果1.鉴定结果①在相差显微镜下,细胞外观多为长梭形、多角形或不规则形状。核呈圆形、卵圆形。细胞可出现重叠生长现象,呈“峰-谷样”生长。②免疫荧光鉴定结果显示抗肌球蛋白抗体染色阳性,表明所获细胞为SMC,细胞纯度达95%以上。2. Western blot分析用转染TRPC6基因的HEK293细胞作阳性对照和转染空白媒介的HEK293细胞作为阴性对照,发现在正常的大鼠ASMC中有很高水平的TRPC6通道蛋白表达。3. MTT法检测不同浓度的SKF96365 (10,50,100μmol/L)处理ASMC以后,与AngⅡ组相比,细胞的增殖活性有显著性地降低,并呈浓度依赖性(p < 0.05)。而用不同浓度FFA (10,20,40μmol/L)处理细胞后,与空白组相比,ASMC增殖活力明显升高(p < 0.05)。4.钙离子成像FFA ( TRPC6通道激动剂,50μmol/L)对AngⅡ(1μmol/L)引起的[Ca2+]i的升高没有明显的影响(n = 8,p > 0.05)。SKF96365 ( TRPC通道阻滞剂,50μmol/L)对AngⅡ(1μmol/L)引起的细胞内的钙离子浓度的升高有明显的抑制作用(n = 10,p < 0.05)。结论TRPC6通道蛋白在正常的胸主动脉平滑肌细胞中有高水平的表达,在AngⅡ诱导的ASMC异常增殖中起很重要的作用,可能是通过改变细胞内游离钙离子浓度进而调控了细胞增殖过程。