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目的:通过构建稳定的高表达mi R-7人胃癌SGC-7901细胞,研究miR-7高表达对DADS通过阻断EGFR/Rac1/Pak1通路抑制SGC-7901细胞EMT与迁移侵袭的影响及其分子机制,证明mi R-7是DADS抑制SGC-7901细胞EMT与迁移侵袭的靶点之一,为胃癌的治疗和DADS的开发应用提供依据。方法:通过慢病毒转染SGC-7901细胞,建立稳定的高表达miR-7的SGC-7901细胞系;通过靶基因预测软件证实EGFR是miR-7的靶基因;相差显微镜观察体外培养的各组SGC-7901细胞的形态;MTT、细胞划痕、小室迁移和侵袭实验检测DADS及mi R-7高表达对SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭的作用;qRT-PCT实验检测各组细胞EGFR、Rac1、Pak1 mRNA表达;Western blot检测各组SGC-7901细胞EGFR、Rac1、Pak1和EMT相关分子β-catenin、Vimentin、E-cadherin蛋白表达;免疫荧光检测各组SGC-7901细胞EGFR、Rac1、Pak1、Vimentin、E-cadherin表达与定位。结果:1.稳定高表达miR-7的SGC-7901细胞的构建将miR-7高表达慢病毒载体与慢病毒空载体分别转染SGC-7901细胞,同时加入聚凝胺polybrene助转剂促进慢病毒的转染,再用puromycin培养细胞,运用荧光显微镜察看转染的细胞,视野内能看到大量带绿色荧光的细胞,qRT-PCR检测结果显示,SGC-7901+DADS组、空载体+DADS组、mi R-7高表达组与miR-7高表达+DADS组较SGC-7901和空载体组miR-7 mRNA明显增加(P<0.05),且miR-7高表达+DADS组高于各组(P<0.05)。表明高表达miR-7的SGC-7901细胞系和空载体SGC-7901细胞系构建成功,继续筛选并传3代后,冻存细胞系备用。2.预测EGFR是miR-7靶基因通过Target Scan、Pic Tar与mi Randa等生物信息学软件预测软件发现EGFR 3’-UTR含有与mi R-7结合位点为GUCUUCC。3.各组SGC-7901细胞的形态变化相差显微镜观察各组SGC-7901细胞形态发现,SGC-7901组与空载体组细胞增殖活跃,大部分为梭形或多边形,核异型性明显;而DADS处理后细胞生长抑制,梭形细胞减少,形态变圆,其中,高表达mi R-7+DADS组大部分细胞呈圆形或椭圆形。表明DADS与mi R-7高表达可抑制SGC-7901细胞EMT。4.miR-7高表达及DADS对SGC-7901细胞增殖的影响MTT检测结果显示,24h、48h和72h后,miR-7高表达组增殖率较SGC-7901和空载体组分别下降86.54%、74.25%与65.65%和86.54%、73.90%与65.39%(P<0.05)。DADS处理24h、48h和72h后,SGC-7901+DADS组分别较SGC-7901细胞组和空载体组增殖率明显下降82.26%、71.90%与63.09%和82.57%、72.53%与63.39%(P<0.05)。miR-7高表达+DADS组较SGC-7901细胞组和空载体组细胞增殖率分别下降74.92%、60.91%与51.97%和74.92%、60.63%和51.76%(P<0.05)。mi R-7高表达+DADS组较miR-7组增殖率明显下降86.57%、82.03%与70.16%(P<0.05)。表明DADS与mi R-7高表达可呈时间依赖性抑制SGC-7901细胞的增殖,mi R-7高表达可增强DADS抑制增殖作用,DADS能上调mi R-7抑制SGC-7901细胞增殖。5.miR-7高表达及DADS对SGC-7901细胞迁移侵袭的影响Transwell迁移实验结果显示,mi R-7高表达组迁移的细胞数84.6±7.3个较SGC-7901组186.4±6.8个与空载体组184.6±6.7个明显减少(P<0.05);SGC-7901+DADS组迁移细胞数105.0±7.2个与空载体+DADS组95.1±6.2个较未处理组明显减少(P<0.05);miR-7高表达+DADS组迁移细胞61.0±6.3个最少(P<0.05)。划痕实验显示,mi R-7高表达组迁移率28.0%较SGC-7901组42.1%与空载体组41.9%明显下降(P<0.05);SGC-7901+DADS组迁移率31.9%与空载体+DADS组30.7%较未处理组下降(P<0.05);miR-7高表达+DADS组迁移率10.6%最低(P<0.05)。表明mi R-7高表达和DADS可抑制SGC-7901细胞迁移,miR-7高表达可增强DADS抑制迁移作用,DADS能上调miR-7抑制SGC-7901细胞迁移。Transwell侵袭实验显示,miR-7高表达组穿膜细胞24.0±3.8个较SGC-7901组60.4±6.5个与空载体组61.2±4.3个明显减少(P<0.05);SGC-7901+DADS组26.8±3.3个与空载体+DADS组25.6±4.0个较未处理组穿膜细胞数明显减少(P<0.05);mi R-7高表达+DADS组8.6±2.1个穿膜细胞最少(P<0.05)。表明miR-7高表达和DADS可抑制SGC-7901细胞侵袭,miR-7高表达可增强DADS抑制侵袭作用,DADS能上调miR-7抑制SGC-7901细胞侵袭。6.DADS和mi R-7高表达对EGFR、Pak1、Rac1表达的影响qRT-PCR和Western blot结果显示,DADS处理较未处理组细胞EGFR、Pak1、Rac1表达下调(P<0.05),高表达miR-7组较对照组EGFR、Rac1、Pak1表达下调(P<0.05);高表达miR-7+DADS组下调最为明显(P<0.05)。表明DADS与mi R-7高表达可调控EGFR/Rac1/Pak1通路。免疫荧光检测显示,DADS处理组较未处理组的EGFR、Pak1与Rac1荧光减弱,高表达mi R-7组较空载体荧光强度明显降低,高表达mi R-7+DADS组荧光最弱。结果与qRT-PCR和Western blot结果一致。7.DADS和miR-7高表达对EMT相关蛋白表达的影响Western blot结果显示,DADS处理较未处理组细胞β-catenin与Vimentin表达下调和E-cadherin表达上调(P<0.05);高表达miR-7组较对照组β-catenin与Vimentin蛋白表达下调和E-cadherin表达上调(P<0.05);高表达miR-7+DADS组变化最为明显(P<0.05)。表明DADS与miR-7高表达可抑制SGC-7901细胞的EMT;miR-7高表达可增强DADS抑制EMT;DADS能上调mi R-7抑制SGC-7901细胞EMT。免疫荧光检测显示,DADS处理组较未处理组的Vimentin荧光减弱;E-cadherin荧光增强,高表达miR-7组较空载体Vimentin荧光减弱;E-cadherin荧光增强,高表达mi R-7+DADS组Vimentin荧光最弱;E-cadherin荧光最强。结果与Western blot结果一致。结论:1.DADS上调miR-7通过EGFR/Rac1/Pak1通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与迁移侵袭。2.miR-7高表达能增强DADS通过EGFR/Rac1/Pak1通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT和迁移侵袭。