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甾体类药物在临床上应用广泛,是仅次于抗生素的第二大类药物。目前甾体的合成主要采用化学半合成法和微生物法,微生物法常应用于生产雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)、雄甾-1,4-烯-3,17-二酮(ADD)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)等前体物质。9α-OH-AD在临床上常作为皮质激素、抗雄性激素、抗雌性激素与避孕功能药物使用,具有重要的商业价值。目前,应用于生产9α-OH-AD的菌株多为分枝杆菌属与红球菌属,现有方法存在着环境污染严重、产率低等问题。大肠杆菌无论是在菌种安全性、菌体生长速度、实验操作和工业生产上均有较大的优势,利用大肠杆菌构建工程菌株进行9α-OH-AD的制备已经成为当前的研究热点。本文以3-甾酮-9α-羟基化酶系统(KSH)为研究对象,以大肠杆菌为宿主菌,高效表达了 3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)与3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB),通过共表达KshA、KshB、构建KshA与P450BM-3还原域的融合蛋白,以检测电子传递功能域对KshA活性的影响,最后又检测了辅酶再生系统在催化体系中的作用。1)高效表达了红平红球菌和分枝杆菌来源的KshA酶,结果发现红平红球菌的KshA酶对底物AD具有较好的催化活性,并基于大肠杆菌,以AD为底物,对制备9α-OH-AD的催化反应进行了探索。最终在底物浓度500 μM的条件下,9α-OH-AD得率达到97.09%。2)高效表达同样来源于红平红球菌的KshB酶,并使用Ni柱亲和层析的方法将KshB酶纯化出来,使用纯化后的KshB酶进行反应证明,KshB是一种辅酶NADH依赖型的还原酶。3)对表达KshA-P450融合蛋白和共表达了 KshA、KshB酶的工程菌株分别进行了制备9α-OH-AD的活性检测实验,最终表达融合蛋白KshA-P450的菌株取得了较好的结果,反应速度是单独表达KshA菌株的2.18倍。4)对课题组原有的fdh基因进行了一个三位点同时突变实验,获得基因fdh3m。并以此基因为基础构建质粒pETDuet-fdh3m,用于NADH、NADPH辅酶再生体系的构建;成功构建共表达kshA、kshB、fdh3m的质粒和共表达kshA-p450、fdh3m的质粒,并成功地进行了蛋白表达,同时检测到重组菌株对AD的9α-羟基化催化活性。