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原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的消化系统恶性肿瘤。据世界卫生组织统计,在全球范围内肝癌死亡率列第五位。而在我国,其死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第二位,仅次于胃癌。目前我国每年有11-13万人死于原发性肝癌,占全球肝癌死亡人数的45%左右。因此HCC的防治已成为我国乃至全球亟待解决的公共卫生问题之一。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染与原发性肝细胞癌关系密切,是我国肝细胞癌发生的主要病因之一。近年来,关于HBV感染在HCC的发生、发展以及转归中的作用的研究已经成为分子生物学领域的热点。有研究显示,HBV X蛋白在HBV感染所致原发性肝细胞癌的发生与发展中起重要作用,但确切的发病机制至今尚未完全阐明。宿主免疫应答水平是影响肿瘤发生、发展与转归的重要因素之一。肝癌细胞免疫逃逸在原发性肝细胞癌的发生与发展中起重要作用,探讨肝癌细胞的免疫逃逸机制有助于设计针对肝癌的免疫治疗策略。主要组织相容性II类分子(major histocompatibility complex II,MHC-II)作为向Th细胞提呈外来抗原的的主要提呈者,在抗感染免疫和抗肿瘤免疫中起重要作用。已有研究表明,肿瘤细胞缺乏HLA-DR(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)表达是乳腺癌、结肠癌等发生免疫逃逸的重要机制。II类反式激活因子(Class II transactivator,CIITA)作为调控HLA-DR表达的“限速因子”,在调控细胞HLA-DR表达与否及水平中起决定作用。有报道指出,胃癌、结肠癌等肿瘤细胞中CIITA基因表达沉默是其缺乏诱导性HLA-DR表达的关键机制。同样的报道还来自人肝癌细胞株HepG2,但是HBV相关性肝癌细胞中是否也存在类似情况,目前尚无明确报道。CIITA由IFN-γ诱导,受其本身基因启动子Ⅳ调控,其转录沉默的机制在黑色素瘤细胞、白血病细胞等肿瘤细胞中已经研究清楚,然而,在HBV相关性肝癌细胞中的研究尚少。因此,研究CIITA基因转录沉默在HBV相关性肝细胞癌发病机制中的作用已非常紧迫。宿主基因转录表观遗传沉默主要由基因启动子甲基化和/或组蛋白去乙酰化所致,DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,Dnmts)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)分别在其过程中起重要作用。因此,本研究收集2009年1月-12月在我院肝胆外科住院并行手术治疗的51例原发性肝细胞癌患者手术切除的标本和临床资料,系统检测肝癌组织中CIITA、HLA-DR、Dnmts与ERK的表达状况,应用目前公认的DNA甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)与染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)检测肝癌组织中CIITA PⅣ启动子甲基化和CIITA组蛋白H3的去乙酰化状态,分离培养原代人肝癌细胞并探讨IFN-γ、甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对人肝癌细胞CIITA、HLA-DR表达的影响,对结果进行系统分析。主要研究结果1、51例HCC患者肝癌组织中HLA-DR蛋白阳性检出率为25.5%(13/51),显著低于癌周肝组织(100%,51/51,χ~2=60.56,P<0.05);所有患者肝癌细胞中均无HLA-DR蛋白表达,其中13例患者肝癌组织中的淋巴细胞有少量HLA-DR蛋白表达,51例HCC患者癌周肝组织的肝细胞中均有不同程度HLA-DR蛋白表达。51例HCC患者肝癌组织中CIITA蛋白与mRNA阳性表达分别为27.5%(14/51)和0(0/51),显著低于癌周肝组织中CIITA蛋白(100%,51/51,χ~2=58.06,P<0.05)与mRNA(100%,51/51,χ~2=102.00,P<0.05)的阳性表达。HCC患者肝内HLA-DR表达水平与CIITA蛋白表达水平呈显著正相关(rs=0.886,P<0.05),缺乏CIITA蛋白表达的肝癌组织均不表达HLA-DR。2、51例HCC患者的肝癌组织与癌周肝组织中CIITA启动子Ⅳ甲基化检出率分别为68.6%(35/51)和25.5%(13/51),两者间相差非常显著(χ~2=19.05,P<0.05)。其中肝癌组织中超甲基化率为35.30%(18/51),半甲基化率为33.30%(17/51),癌周肝组织中均为半甲基化。超甲基化的组织中CIITA mRNA表达水平为5.90±2.50,显著低于半甲基化的组织(7.09±3.16,P=0.045),无甲基化的组织中CIITA mRNA表达水平为13.95±4.83,显著高于半甲基化的组织(P<0.05)。Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b蛋白在HCC患者癌周肝组织中的阳性表达率分别为17.65%(9/51)、19.61%(10/51)和21.57%(11/51),在肝癌组织中的阳性表达率分别为100%(51/51),92.16%(47/51)和94.12%(48/51),两者间相差非常显著(P<0.05)。HCC患者肝内Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b表达水平与CIITA启动子Ⅳ甲基化状态呈显著正相关(r_s分别为0.512、0.507和0.621,P<0.05)。原代培养的人肝癌细胞不表达CIITA和HLA-DR,经过IFN-γ诱导后也不表达,经过5-Aza-CdR处理后能表达CIITA与HLA-DR。3、51例HCC患者癌周肝组织中ERK1蛋白阳性表达率为31.37%(16/51),显著低于肝癌组织(100%,51/51,χ~2=54.28,P<0.05)。51例HCC患者肝癌组织中ERK mRNA的阳性检出率为100%(51/51),相应的癌周肝组织中均未检测到其表达(0,0/51),差异有统计学意义(χ~2=102.00,P<0.05)。4例HCC患者的癌周肝组织中CIITA组蛋白H3处于乙酰化状态,而在其相应的肝癌组织中处于去乙酰化状态。CIITA组蛋白H3去乙酰化的肝癌组织中,ERK均为阳性表达,CIITA均为阴性表达,而在CIITA组蛋白H3乙酰化的相应的癌周肝组织中,ERK表达均为阴性,CIITA均为阳性表达。原代培养的人肝癌细胞在TSA单独或联合5-Aza-CdR处理后均能恢复表达CIITA与HLA-DR。结论1、HBV相关肝细胞癌患者的肝癌细胞不表达HLA-DR与其缺乏CIITA表达密切相关,并可能在肝癌细胞免疫逃逸中起重要作用。2、HBV相关性肝细胞癌患者的肝癌细胞CIITA基因启动子Ⅳ处于高甲基化状态;启动子Ⅳ异常甲基化所致的CIITA基因表观遗传沉默是引起肝癌细胞不表达CIITA的重要机制之一,并可能在HBV相关性肝细胞癌发病机制中起重要作用。3、肝癌细胞DNA甲基转移酶的过量表达是导致CIITA启动子Ⅳ异常甲基化的重要原因。4、HBV相关性肝细胞癌患者的肝癌细胞存在CIITA组蛋白H3的去乙酰化,并可能与肝癌细胞中CIITA基因转录表观遗传沉默有关。