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研究背景:黑色素细胞来源于神经嵴。随着胚胎的发育,神经嵴细胞及其产物通过背外侧、腹外侧途径形成成黑素细胞,向毛囊、表皮、眼葡萄膜、软脑膜和内耳迁移,使毛发和皮肤着色并且参与听力和视力的调节。当黑色素细胞系发育障碍时,会引起听力、视力的丧失,皮肤色素沉着障碍性疾病以及黑色素瘤。环境污染、内在毒素均能影响黑色素细胞的发育。上述疾病的研究及毒理学评价工作的开展均可以黑色素细胞和黑色素干细胞作为种子来源,但其体外传代能力有限,易于分化,满足不了细胞生物学研究的需求。PBX1是细胞转录因子,可维持干细胞的自我更新及干性,且具有促进细胞增殖作用。研究目的:研究过表达PBX1对人皮肤黑色素(干)细胞的增殖作用,探讨过表达PBX1促进人皮肤黑色素(干)细胞增殖的相关机制。研究方法:1.人皮肤黑色素(干)细胞的分离、培养与鉴定取行包皮环切术的成年人、青少年包皮组织,分别把组织剪切成1 mm×1 cm大小,浸泡于DispaseⅡ溶液中,4℃冰箱过夜,分离真、表皮组织。次日,用含EDTA的0.25%胰酶消化表皮组织,获取细胞,离心后用选择培养基培养细胞,RT-PCR、免疫荧光、Western Blot方法检测人源黑色素细胞特异性生物标记物;MTT法检测OD值并绘制人皮肤黑色素(干)细胞的增殖曲线,计算群体倍增时间。2.过表达PBX1人皮肤黑色素(干)细胞的制备将psPAX2、pMD2G和PBX1质粒与EndoFectinTM-MaX转染试剂混合后,转染至293 T细胞。分别收集转染后36h、60h的病毒上清,超滤管内离心、浓缩后,与LV-Enhance混合,加入到人皮肤黑色素(干)细胞。3天后,荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况、计数细胞、计算转导效率。采用免疫荧光、Western Blot法检测过表达PBX1的人皮肤黑色素(干)细胞特异性标记物表达情况。3.过表达PBX1对人皮肤黑色素(干)细胞增殖的影响利用MTT检测过表达PBX1对人皮肤黑色素(干)细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期并计算增殖指数;Western Blot检测增殖信号通路关键蛋白STAT3,AKT,ERK表达情况;给予ERK抑制剂,利用计数法、Western Blot检测其对人皮肤黑色素干细胞增殖的影响;流式细胞术检测其对人皮肤黑色素干细胞周期的影响。4.过表达PBX1对人皮肤黑色素(干)细胞增殖相关机制探讨Western Blot检测过表达PBX1对人皮肤黑色素(干)细胞周期相关蛋白表达的影响。实验结果:1.人皮肤黑色素(干)细胞的分离、培养与鉴定显微镜下可见:分离、培养的人皮肤黑色素细胞呈两极或三极的形态;人皮肤黑色素干细胞呈纺锤形。RT-PCR结果可见:成年人包皮组织获取的细胞表达基因TYR、TYRP1、MITF、TYRP2、C-KIT、SOX10、PAX3,免疫荧光、Western Blot检测,结果可见:成年人包皮组织获取的细胞表达蛋白TYR、TYRP1、MITF,即为人皮肤黑色素细胞;青少年包皮组织获取的细胞表达基因TYR、TYRP1、MITF、TYRP2、C-KIT、SOX10、PAX3,免疫荧光、Western Blot检测,结果可见:青少年包皮组织获取的细胞表达蛋白MITF,不表达TYR、TYRP1,即为人皮肤黑色素干细胞。MTT的结果计算可知:人皮肤黑色素细胞群体倍增时间为141.2 h;人皮肤黑色素干细胞群体倍增时间为80.8 h。2.过表达PBX1人皮肤黑色素(干)细胞的制备显微镜下可见:转染PBX1的293 T细胞贴壁生长、状态良好,转染效率较高。将收集的病毒转导至人皮肤黑色素(干)细胞。荧光显微镜观察:随着培养时间的延长,荧光百分比逐渐增多,细胞折光度强,细胞状态较好;Cytation3细胞成像多功能微孔板检测系统计数转导的阳性率,结果可见:人皮肤黑色素细胞eGFP组阳性率为94%,过表达PBX1组阳性率为82%。人皮肤黑色素干细胞eGFP组阳性率为83%,过表达PBX1组阳性率为71%;免疫荧光、Western Blot结果可见:过表达PBX1后,人皮肤黑色素细胞仍表达蛋白TYR、TYRP1、MITF。人皮肤黑色素干细胞仍表达蛋白MITF,不表达TYR、TYRP1。3.过表达PBX1对人皮肤黑色素(干)细胞增殖影响同相应eGFP组比较,MTT的结果显示:过表达PBX1组人皮肤黑色素(干)细胞增殖均较快;流式细胞术结果显示:过表达PBX1促进人皮肤黑色素(干)细胞S期细胞比例增加、增殖指数提高;Western Blot结果显示:过表达PBX1可以使人皮肤黑色素(干)细胞p-EKR表达量增加;给予过表达PBX1的人皮肤黑色素干细胞ERK抑制剂后,细胞数减少,细胞周期进程受阻。4.过表达PBX1对人皮肤黑色素(干)细胞周期相关蛋白影响。Western Blot结果显示:过表达PBX1可使人皮肤黑色素细胞的P21表达下调,E2F、CyclinD1表达上调;过表达PBX1可使人皮肤黑色素干细胞P21表达下调,CyclinE1、CDK2表达上调。结论:1.成功在体外分离、培养人皮肤黑色素(干)细胞;2.成功制备过表达PBX1人皮肤黑色素(干)细胞;3.过表达PBX1通过上调磷酸化ERK、影响细胞周期相关蛋白促进人皮肤黑色素(干)细胞增殖。