前言宫颈癌是女性生殖系统常见的肿瘤,其发病率居恶性肿瘤之首,是女性生殖系统恶性肿瘤死亡的主要原因之一,所以宫颈癌的早期诊断有着重要的意义。本实验应用瘤细胞悬液移植法,在具有正常免疫功能的大鼠体内建立大鼠宫颈癌移植瘤动物模型,为宫颈肿瘤的早期诊断提供前期的动物实验依据。探讨大鼠宫颈癌移植肿瘤组织中的有丝分裂原激活蛋白激酶P38的表达及其临床意义;研究P38的高表达与淋巴结转移的关系。同时应用新一代超声造影剂声诺维观察造影对实验兔肌肉内人宫颈癌移植肿瘤的血流灌注显像的影响,评价声诺维(SonoVue)在超声显像中的造影增强作用,探讨及检验不同造影剂剂量在二次谐波显像中对兔宫颈癌移植瘤造影效果的影响与变化规律,为临床肿瘤诊断和鉴别诊断提供依据。方法第一部分:体外培养HELA细胞,采用细胞记数法观察细胞生长情况。将对数生长期的HELA按2.5×10~7、2.5×10~6、2.5×10~5分别接种于大鼠的背部皮下、腹腔内、静脉注射,建立宫颈癌移植瘤动物模型,并于接种后观察成瘤率、肿瘤生长及播散情况及动物生存期,于种植后第7D、10D、14D、17D、21D行超声检查,然后等到实验鼠自然死亡,并对肿瘤进行病理学检查,确定肿瘤的存在及性质。第二部分:应用免疫组织化学方法和Western-blot方法检测人宫颈癌鼠移植瘤及其癌旁正常组织中P38及磷酸化P38的蛋白表达情况。(一)免疫组化法1.按照试剂盒说明书步骤抗p38免疫组化染色。切片常规脱蜡致水,高温高压抗原修复,一抗4℃孵育过夜,DAB显色,苏木素复染。PBS代替一抗作为阴性对照,用已知宫颈癌阳性片做阳性对照。2.结果判定:在双盲法下进行,以肿瘤细胞内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片在光、镜下随机选取5个视野,每个视野计数100个瘤细胞,着色强度分为无色(一)为0分,浅黄色(+)为1分,黄色及棕黄色(++)为2分;阳性细胞数＜10%为0分,10%—50%为1分,＞50%为2分。两项得分相乘结果≥2记为阳性。(二)Western blot法取-70°保存的移植瘤及癌旁正常组织约100mg加入预冷的蛋白裂解液,剪碎,匀浆超声处理,高速低温离心提取上清为细胞总蛋白。电泳(12%SDS-PAGE凝胶)、转印,5%脱脂奶粉封闭液封闭1h,一抗4℃孵育过夜,与相应二抗室温下孵育2h,曝光,双蒸水冲洗,干燥,避光保存,结果经自动电泳凝胶成像分析仪(chemilmager 5500,Alpha Innotech,USA)采集,进行灰度值测定。第三部分:建立兔宫颈癌移植瘤模型十只。彩超每周观察肿瘤生长情况,共10周,于1～4周测量血流动力学参数;同时,患有宫颈癌移植瘤的兔分别经耳缘静脉团注法注射声学造影剂0.2、0.4、0.6ml/kg,然后用二次谐波显像观察肿瘤造影效果;应用彩色多普勒、能量多普勒观察兔肌肉层内移植瘤血流灌注情况并定量分析。结果第一部分:在体外培养条件下的HELA细胞生长迅速,将不同数量的HELA细胞接种大鼠不同部位后,成瘤率为67%,迅速发生腹腔播散并产生大量腹水,其生物学行为与人宫颈肿瘤相似。肿瘤细胞负荷增加,动物生存期明显缩短(p＜0.01)。三组模型的组织病理学检查无明显差别。肿瘤的内部回声可分为高回声、等回声、低回声三类,随着肿瘤的生长其回声类型有所转变;鼠的人宫颈癌移植瘤的生长状况、回声类型及血供变化的动态演化大体符合宫颈癌的一般超声表现特点。该种植瘤的增长是进行性的,超声征象随肿瘤的进展而逐步体现,基本符合肿瘤侵袭的定义特征,该动物模型可用于超声对宫颈癌恶性生物学行为的观察。第二部分:P38在宫颈癌移植瘤组织中的表达阳性率为95.5%,在癌旁正常组织中的表达为33.1%。P38在宫颈癌移植瘤中的表达明显高于癌旁组织,有显著的统计学差异(P＜0.01)。P38的表达定位于胞质中,胞核中无表达;P38的表达与病程、肿瘤大小、肿瘤位置无明显相关。P38的表达与组织分化程度及有无淋巴结的转移有显著差异(P＜0.01)。第三部分:在兔的宫颈癌移植瘤模型中:PDI可探及星点状、短棒状和条状血流,各时期RI和PI值无显著性差异。造影后增强了肌肉内移植瘤的血管显示率及血流信号强度,肿瘤造影表现为快速增强,缓慢减退,持续时间较长的特点;新型声学造影方法可以明显增强肿瘤的二维超声影像。结论在具有正常免疫功能的大鼠体内成功建立的宫颈癌移植瘤模型能较好地模拟人自发宫颈癌的生物学特征,有助于了解宫颈癌生物学及免疫学特性,可作为良好的肿瘤模型用于宫颈癌的免疫治疗研究及进行影像学的研究。该种植瘤超声征象随肿瘤的进展而逐步体现,基本符合肿瘤侵袭的定义特征,该动物模型可用于超声对宫颈恶性肿瘤生物学行为的观察。本实验虽然属于临床前期的动物研究,但肿瘤直径基本≤3cm,其超声常规指标的动态观测将有助于临床早期宫颈肿瘤的诊断与鉴别。声学造影提高了兔肌肉内宫颈癌移植瘤血流灌注的显示,增强其血流信号,造影显像优于彩色多普勒显像。P38在宫颈肿瘤的细胞中呈高表达,并与病程进展密切相关,与宫颈癌的发生、发展及转移密切相关。