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目的:太子参环肽HB(HeterrophyllinB,HB)是太子参的指标性成分,具有抑制酪氨酸酶合成而减少皮肤中黑色素生成的药理作用。本研究旨在从太子参中筛选并克隆环肽HB的功能基因,并进行基因结构与功能验证,从基因水平研究太子参环肽HB物质的形成机制及探讨相关的影响因素提供理论依据。方法:1.运用生物信息学方法从太子参转录组数据库中获得多个环肽类Unigenes序列,通过同源克隆和RACE技术克隆太子参环肽HB前体蛋白基因;运用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和液质联用技术(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer,LC-MS)对环肽 HB 前体蛋白基因的体外酶促反应产物进行检测;构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,转基因植株运用PCR鉴定。2.采用HPLC法和(Real-Time Quantitative PCR,RT-qPCR)技术分别检测太子参中太子参环肽HB的含量和prePhHB基因的表达量,Excel软件分析相关性;通过PCR扩增与TA克隆研究太子参环肽HB前体蛋白基因的突变或缺失。3.利用酶联免疫测定法对外源激素处理太子参植株体内的内源脱落酸、赤霉素、吲哚乙酸、玉米素核苷、茉莉酸甲酯的含量进行分析,RT-qPCR技术研究prePhHB基因在其太子参中表达特性,进而研究内源激素对prePhHB基因表达量的影响。结果:1.采用同源克隆的方法从太子参中克隆得到3条太子参环肽前体蛋白基因的编码区序列(coding sequence,CDS),大小均为108 bp,分别是太子参环肽HB和太子参环肽G(preheterrophyllin G,PG)的前体蛋白基因,命名为prePhHB、prePhPG1和prePhPG2,并通过RACE技术克隆得到太子参环肽HB前体蛋白基因的3’序列和5’序列,大小分别为80 bp和126 bp。2.在从太子参韧皮部提取粗酶的催化作用下所得的反应产物,经HPLC和LC-MS分析表明为太子参环肽HB,说明prePhHHB是太子参环肽HB的前体蛋白基因。3.成功构建了重组植物表达载体PLGNL-prePhHB,并通过农杆菌介导法将重组质粒PLGNL-prePhHB转化到模式植物烟草中,获得50株再生植株,通过PCR扩增对再生植株进行检测,结果显示所检测的16株再生植株均为阳性,故初步证实prePhHB基因已成功转入到烟草中。4.CORREL分析结果表明,不同产区太子参环肽HB含量与prePhHB基因的表达量呈正相关,表明prePhHB基因表达量的多少对太子参中环肽HB的含量具有决定性作用。5。prePhHB基因的PCR扩增与TA克隆研究结果表明,江苏句容、贵州施秉和安徽宣州太子参prePhHB基因的前体线性肽均为IFGGLPPP,但福建柘荣还出现了 IFGGLPFPP和IFGGLPP2种形式,推测其环肽HB前体线性肽出现基因的突变和缺失。6.通过外源ABA和GA3干扰太子参生长发育,发现较高含量的内源ABA和内源GA3均有利于增加prePhHB基因的表达量,其中内源ABA主要在初期大幅度的增加了prePWhHB基因的表达,内源GA3则主要是在后期。结论:本论文从太子参中克隆出了太子参环肽HB和太子参环肽PG的前体蛋白基因的CDS序列,获得了 prePhHB基因的全长cDNA序列。体外酶促反应和体内转基因功能验证了 prePhHB基因是太子参环肽HB的功能基因。探明了不同栽培地区太子参中环肽HB含量与prePhHB基因的表达量呈显著正相关,发现了福建柘荣产区太子参环肽HB的前体线性肽发生了基因突变,突变后的前体线性肽为IFGGLPFPP和IFGGLPP,推测这可能是导致福建柘荣太子参中环肽HB含量低的原因。此外,prePhHB基因的表达情况还与内源ABA和内源GA3的含量有直接关系。