研究背景及目的卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性常见的妇科恶性肿瘤之一,其致死率高居妇科肿瘤之首,有确诊时多为晚期的特点,其中上皮性卵巢癌最常见。铂类药物是卵巢癌化疗的首选药物,有着重要的地位。而铂类化疗耐受或抵抗是卵巢癌复发、转移的重要原因之一。克服铂类化疗耐受或者抵抗的难题成为卵巢癌治疗的重要环节。近些年针对铂类化疗耐受或抵抗问题,开展了单一非铂类化疗药物和分子靶向药物治疗的研究,但疾病控制和延长生存时间方面并不尽如人意。因此,寻找其他能够提高铂类疗效的药物或成为卵巢癌治疗的重要方向。具有悠久历史的中医药是一个巨大的宝库,在中国长期的肿瘤防治医疗实践中起到了重要的作用。很多中药如在具有抗多种肿瘤作用的同时,还对肿瘤化疗起到减毒增敏的作用,改善化疗相关症状,提高肿瘤患者生存质量,延长生存时间。中药作为补充治疗对提高患者耐受化疗的能力和化疗的效果有着积极的意义,因此结合医学在恶性肿瘤的治疗中具有一定的优势。中药蟾皮功能清热解毒、利水消肿,含有较多的活性成分,具有抗肿瘤、抗肝炎病毒等药理活性,临床用于治疗原发性肝癌、肺癌、肠癌及慢性肝炎等疾病。在抗卵巢癌方面,我们发现具有较好的临床疗效,尤其对于复发耐药性卵巢癌患者,可改善肿瘤晚期临床症状,提高生存质量,延长生存时间。但有部分患者服用蟾皮有明显的恶心、甚至呕吐的胃肠道反应,常常不能耐受。另外,蟾皮这种来源于蟾蜍的药材有小毒。蟾皮的毒性和胃肠道副反应使其在抗卵巢癌口服治疗中的使用受限制。因为蟾皮的活性成分复杂,我们考虑若能进行蟾皮有效成分抗卵巢癌作用方面的筛选研究,明确其在抗卵巢癌方面的优效成分,减少其胃肠道反应,将大大提高其临床使用的接受度、用药安全性,使其更好的在临床上应用。并且,我们通过体内外实验,对蟾皮有效成分对卵巢癌细胞增殖活性抑制作用及机制进行了进一步的探索,为今后中西结合临床治疗卵巢癌提供理论基础。本研究分为以下四部分:1.蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的筛选;2.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响;3.酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究;4.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制研究。第一章蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的的筛选方法:5种蟾皮活性成分酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛配置浓度梯度0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500μM作用于卵巢癌SKOV3细胞72小时,用In cell 2000 analyzer统计存活细胞数目,计算细胞存活率。筛选出抑制作用较强的2种成分,进一步作用于人胸水来源的卵巢癌原代细胞72小时,计算细胞存活率。结果:5种蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞活性作用,在浓度高于20μM时,有明显的量-效关系;72小时测定并计算酯蟾毒配基IC50=48.62μM,蟾毒它灵IC50=86.86μM;其余脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和水溶性成分蟾蜍噻咛抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖活性作用较弱。酯蟾毒配基和蟾毒它灵在浓度高于20μM时,对人胸水来源的卵巢癌原代细胞抑制率均高于50%,能明显抑制人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖。结论:蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞和人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖,为5种蟾皮有效成分中抑制卵巢癌细胞增殖活性的优势成分。第二章酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响方法:酯蟾毒配基配置浓度梯度20、100、500μM单独或与顺铂5μM联合作用于卵巢癌SKOV3细胞24、48、72小时,用MTS方法检测细胞增殖情况。流式细胞术和Hoechst荧光染色法检测细胞凋亡。结果:1、各浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性降低。酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用,随着酯蟾毒配基浓度增加、作用时间的延长而增强。2、当不同浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于空白对照组,酯蟾毒配基组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)及死亡细胞(UL)比例均明显增加,并且这种变化呈现出了剂量依赖性。3、酯蟾毒配基给药处理后,随着酯蟾毒配基浓度(20μM、100μM、500μM)的增加,凋亡小体增多。4、在不同浓度(20μM、100μM、500μM)酯蟾毒配基和5μM顺铂联合作用72小时后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性发生不同的变化趋势。20μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基20μM组(P<0.001),高于顺铂组(P<0.05);100μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基100μM组(P<0.001),低于顺铂组(P<0.01);500μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性与酯蟾毒配基500μM组比较,无显著性差异(P>0.05),低于顺铂组(P<0.001)。5、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于顺铂组,酯蟾毒配基20μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)比例明显减少,晚期凋亡(UR)比例变化不明显。酯蟾毒配基100μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)变化不明显,晚期凋亡(UR)比例有所增加。酯蟾毒配基500μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)比例均明显增加。6、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,Hoechst荧光染色法检测到的凋亡变化情况同流式检测结果一致。结论:酯蟾毒配基能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,具有明显的浓度、时间依赖性。并能促进卵巢癌SKOV3细胞的凋亡。酯蟾毒配基20μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性的效果不及单用顺铂;酯蟾毒配基100μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性效果优于单用顺铂和单用酯蟾毒配基。不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用可产生增强或减弱的影响。第三章酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究方法:卵巢癌细胞SKOV3注射于裸鼠皮下进行移植瘤造模,造模成功后随机分为8组,分别给予低、中、高浓度酯蟾毒配基,低、中、高浓度酯蟾毒配基与顺铂合用进行干预,设置空白对照组和顺铂组,腹腔注射给药,酯蟾毒配基隔日1次,顺铂每周1次,比较各组裸鼠移植瘤体积、瘤重。结果:各组给药后裸鼠皮下移植瘤的生长均受到抑制。酯蟾毒配基低、中、高剂量组各组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为酯蟾毒配基低剂量组(L)<酯蟾毒配基中剂量组(M)<酯蟾毒配基高剂量组(H),顺铂组(PT)、酯蟾毒配基低、中、高剂量和顺铂合用组四组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为L+PT<PT<M+PT<H+PT。结论:酯蟾毒配基能抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长,低剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有拮抗减效作用,中、高剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有协同增效作用。第四章机制研究方法:选择Affymetrix Prime View TMHuman Gene Expression Array表达谱芯片,用基因芯片筛查技术分析卵巢癌细胞SKOV3在接受酯蟾毒配基作用、酯蟾毒配基与顺铂联合作用处理后基因表达的变化,利用生物信息学分析差异基因,通过表达模式聚类分析、GO富集分析、KEGG富集分析,寻找有显著差异变化信号通路及关键分子,通过PCR、Western Blot方法检测关键基因的蛋白表达进行结果验证。结果:1、酯蟾毒配基可能通过调节PI3K/AKT/CREB通路,促进凋亡,抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,是酯蟾毒配基影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用的关键所在。2、PCR结果显示酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,AKT1不表达;与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。3、Western Blot结果显示,酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组、酯蟾毒配基100μM组中AKT水平均降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平均增高。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中AKT水平增高、Caspase3水平降低,磷酸化CREB水平降低;酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中AKT水平降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平增高。结论:1、酯蟾毒配基通过PI3K/AKT/CREB通路,上调Caspase3水平,促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡,可能是酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制。2、CREB可能是卵巢癌SKOV3细胞的抑癌转录因子。3、不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,可能通过PI3K/AKT/CREB通路,调节Caspase3水平,通过凋亡途径对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞的作用产生协同或拮抗影响。