【摘 要】
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研究背景心血管疾病仍然是世界范围内人口死亡的主要原因。成年哺乳动物心脏再生能力主要来源于心肌细胞的增殖能力,但该能力在成年小鼠心肌极为有限,不足以修复心肌梗死后受损心肌。因此如何促进成年心肌增殖成为心肌再生研究的重要科学问题。心肌细胞增殖的机制尚未完全阐明。在斑马鱼和哺乳动物中,增殖型心肌细胞的代谢表型与非增殖型心肌细胞显著不同。心肌细胞增殖能力的丧失或重新激活伴随着葡萄糖和脂肪酸的代谢重编程。代
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研究背景心血管疾病仍然是世界范围内人口死亡的主要原因。成年哺乳动物心脏再生能力主要来源于心肌细胞的增殖能力,但该能力在成年小鼠心肌极为有限,不足以修复心肌梗死后受损心肌。因此如何促进成年心肌增殖成为心肌再生研究的重要科学问题。心肌细胞增殖的机制尚未完全阐明。在斑马鱼和哺乳动物中,增殖型心肌细胞的代谢表型与非增殖型心肌细胞显著不同。心肌细胞增殖能力的丧失或重新激活伴随着葡萄糖和脂肪酸的代谢重编程。代谢重编程导致代谢中间产物谱的显著改变。既往在非心肌细胞的研究表明,某些代谢中间产物（如NAD+、SAM和α-KG）具有直接调控表观修饰酶的能力,其中NAD+在心肌细胞中的含量改变与出生后一周内心肌细胞增殖能力显著下降密切相关。NAD+可调控表观修饰酶的活性,而表观修饰酶可调控细胞周期基因的转录而影响细胞增殖。本研究提出“代谢中间产物NAD+通过调控表观修饰酶SIRT1而影响心肌细胞增殖,通过干预NAD+具有促进心肌增殖再生的治疗作用”的假设,并对NAD+促增殖的作用及其机制进行研究。研究方法第一部分:1.分离新生（P1）和成年（P56）小鼠心脏中心肌细胞,并进行RNA测序,以分析糖脂代谢及NAD+途径相关基因转录水平变化。2.在心肌细胞中外源添加NAD+前体NMN,通过免疫荧光检测增殖标记物Ki67和p H3阳性比例。3.在发育模型中补充NAD+前体NMN,通过增殖标记物检测NAD+在体促增殖作用。取同窝新生小鼠（P7）,实验组每天腹腔注射NMN,对照组注射等量溶剂。7天后取材,进行免疫荧光检测增殖标记物Ki67和p H3阳性比例。4.在心肌梗死（MI）模型中研究NAD+前体NMN对MI的治疗作用。取8周龄的成年小鼠,行冠状动脉前降支结扎术。实验组每天腹腔注射NMN,对照组注射等量溶剂。术后每周超声检测心功能,术后二周取材检测增殖标记物Ki67和p H3阳性比例,术后六周后取材Masson染色检测纤维化瘢痕面积。第二部分:1.探究不同发育阶段心脏组织NAD+含量变化情况。利用NAD+检测试剂盒检测新生（P1）和成年（P56）小鼠心脏组织的NAD+水平。2.在细胞实验中检测SIRT1抑制剂对NMN的促增殖作用的影响。在培养基中加入NMN,并同时加入SIRT1抑制剂,处理24小时。通过增殖标记物Ki67和p H3在心肌细胞中的阳性比例,检测SIRT1抑制剂对NMN促增殖作用的影响。3.在心肌细胞中明确与心肌细胞增殖相关的“NMN-组蛋白去乙酰化位点”。NMN处理24小时后收集细胞。通过Western blot检测已报道的SIRT1去乙酰化酶调控组蛋白乙酰化修饰,找到用NMN处理后显著改变的乙酰化修饰位点,并用该位点的特异性抗体进行Ch IP实验,富集发生该位点修饰的基因组DNA片段,并通过PCR对细胞周期基因启动子区进行扩增,检测NMN通过哪些组蛋白乙酰化修饰位点影响了细胞周期基因的转录。研究结果第一部分:1.与P1小鼠相比,P56小鼠心肌细胞发生糖脂代谢重编程及NAD+代谢途径相关基因转录水平发生显著变化。2.外源添加NAD+前体NMN,处理组心肌细胞Ki67和p H3的阳性比例明显高于对照组,且最适药物浓度为1m M。3.在发育模型中,与对照组相比,NMN处理组心体比更大。NMN处理组心脏组织中NAD+含量明显增加。NMN处理后心肌细胞的横截面积小于对照组。NMN处理组心肌细胞Ki67和p H3的阳性比例明显高于对照组。4.在MI模型中,NMN处理组心肌细胞Ki67和p H3的阳性比例高于对照组。NMN处理组小鼠心功能明显改善。此外,与对照组相比,NMN处理组小鼠心脏纤维化瘢痕明显减小。第二部分:1.成年小鼠心脏组织中的NAD+含量明显下降,其下降趋势与出生后心肌细胞增殖能力丢失的趋势一致。2.SIRT1抑制剂能够明显阻断NAD+前体NMN的促心肌增殖作用。3.NMN处理组H3K9ac的蛋白表达量以及p27的m RNA水平降低,提示NAD+的促心肌增殖作用可能是通过H3K9ac和p27。结论:NAD+是代谢重编程促心肌细胞增殖的重要代谢中间产物,NAD+依赖的SIRT1对细胞周期抑制基因启动子区H3K9ac的去乙酰化修饰是其促心肌增殖的主要机制。外源性补充NAD+可以促进心肌细胞增殖,并对心肌梗死具有治疗作用。
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