论文部分内容阅读
目的:子宫内膜是子宫的保护层,子宫内膜炎主要表现在内膜细胞的炎性变化。疾病发生时,淋巴细胞会向患病部位聚集,其相关亚群会发挥各自功能来调节机体免疫。因此,当子宫内膜炎发生时淋巴细胞会向子宫炎症部位聚集并发挥其免疫作用,从而抑制炎症的蔓延。调节性T细胞维持机体免疫耐受,其数量的改变能够直接影响T细胞的免疫功能,进而影响机体的免疫功能。外泌体是细胞释放的带有宿主细胞遗传信息的微小囊泡。本试验旨在探究子宫内膜上皮细胞来源外泌体在子宫内膜炎中分泌对于子宫局部T淋巴细胞的调节作用。对于预防子宫内膜炎、提高免疫效率具有重要参考价值。方法:采用细胞学染色法鉴定健康与患病子宫腔液。用淋巴细胞提取试剂盒提取子宫内的淋巴细胞,分析T淋巴细胞亚型,检测T淋巴细胞FOXP3和IL-17的表达;提取正常培养和LPS处理的子宫内膜上皮细胞的外泌体并进行外泌体形态和标志因子鉴定;分选牛Treg并添加两种来源外泌体,荧光定量PCR测定牛Treg相关因子的差异。最后,诱导生成小鼠调节性T细胞并加入外泌体,通过蛋白印迹和免疫荧光方法检测CTLA4、PD-1、Galectin-1的表达变化。结果:①通过腔液细胞学检测发现患病奶牛子宫腔液中出现较多的嗜中性粒细胞,而健康奶牛子宫腔液中未见嗜中性粒细胞浸润;②流式细胞术鉴定患病组T淋巴细胞数量增加的同时亚群数量也发生变化,Tc细胞组成比例显著升高;③健康组FOXP3蛋白的相对表达量极显著增加(p<0.01);健康组IL-17含量极显著低于患病子宫(p<0.01);(④电镜和Western Bolt鉴定分离出的外泌体的形状、大小和相关标志物的表达,可以证明分离成功;⑤外泌体内均有CD9蛋白的表达;⑥相比于无处理组,LPS处理组的奶牛Treg细胞中PD1、CTLA4、Galectin-1 mRNA表达量极显著降低(p<0.01)。⑦小鼠Treg细胞中PD1、CTLA4、Galectin-1和FOXP3蛋白的相对表达量在LPS处理子宫内膜上皮细胞来源外泌体组极显著减少(p<0.01),而IL-17相对表达量在体外炎症模型组显著增加(p<0.05)。结论:①子宫内膜炎改变了子宫局部正常的T淋巴细胞亚群的数量,尤以Treg与细胞毒性T细胞比例的不同变化为主要特征;②炎性刺激的子宫内膜上皮细胞通过分泌的外泌体调节了子宫局部Treg的活化,最终影响子宫局部的免疫微环境的变化。子宫免疫微环境的变化可能是导致子宫内膜炎奶牛妊娠率降低的一个内在原因。