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植物的生长发育受众多因素的影响,包括内因和外因,其中,外在因素主要包括光照、温度和湿度等。植物营固生生长,为了更好地适应周围的环境条件,植物进化并发育形成了精密的分子调控网络,根据外界环境的变化及时调整自身的生理状态,使自身和外界环境始终维持一个平衡态。光照,为植物生长过程中非常重要的环境因素之一,不仅为植物整个生命过程的光合作用提供能源,而且协同众多信号途径调控各个发育过程。然而,过强或过弱的光照强度,都会对植物的生长发育造成不同程度的损伤,为了避免不合适的光照强度造成的损伤,植物发育形成了光抑制以及遮荫反应。研究植物光信号的转导机制不仅能够提供理论基础,而且对农业发展有重要指导意义。本研究以模式植物拟南芥为研究对象,主要研究WRKY2/WRKY10与CCA1/LHY以及SHB1形成的蛋白复合体,特异的在红光条件下诱导PIF4基因的表达。PIF4(PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4)为bHLH家族转录因子,是重要的植物光形态建成的抑制因子,并在植物生长发育的多个方面起作用;SHB1(SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE 1)既参与植物光信号转导,又参与调控MINI3(MINISEED 3)和IKU2(HAIKU 2)基因的表达,调控胚乳发育,从而影响种子大小;CCA1(CIRCADIAN LOCK ASSOCIATED 1)与其同源基因LHY(LATE LONGATED HYPOCOTYL)为生物钟系统核心因子,影响植物中多个信号途径的转导;WRKY2(WRKY DNA-binding protein 2)为WRKY家族转录因子,调控种子萌发和花粉发育;WRKY10(WRKY DNA-binding protein 10)为WRKY家族另一成员,主要在种子胚乳中表达,辅助招募SHB1蛋白至MINISEED 3(MINI3)和HAIKU 2(IKU2)基因启动子上促进它们的表达,调控胚乳发育影响种子大小。本研究发现WRKY2和WRKY10还参与到植物光形态建成过程中,通过增强SHB1-CCA1/LHY调控模块靶向PIF4基因的能力,在红光条件下诱导PIF4基因的表达,在强光照条件下减弱植物的光响应,维持植物光形态建成的平衡态。主要研究结果如下:(1)WRKY2和WRKY10参与植物光形态建成过程。pWRKY10::GUS转基因材料染色显示,WRKY10在黑暗以及红光条件下生长的幼苗的子叶、下胚轴以及根部均有表达。与野生型相比,功能缺失型突变体wrky10在红光条件下,具有短下胚轴表型。WRKY2和WRKY10是同源基因,wrky2 wrky10+/-双突变体有更明显的短下胚轴表型,并且在此突变体中PIF4基因的表达下调,但是PIF4基因的节律表达模式并没有发生改变。(2)WRKY2和WRKY10在红光条件下结合PIF4的启动子。WRKY2和WRKY10为WRKY家族转录因子,含有保守的WRKY类DNA结合结构域,ChIP结果显示WRKY2和WRKY10在红光条件下能够结合PIF4的启动子。酵母单杂交以及凝胶阻滞迁移实验也证明WRKY2和WRKY10能结合PIF4启动子。(3)WRKY2/WRKY10和CCA1/LHY相互作用并增强CCA1/LHY结合PIF4启动子。PIF4启动子上,WRKY2/WRKY10的结合位点和CCA1/LHY的结合位点相邻,免疫共沉淀实验证明WRKY2/WRKY10和CCA1/LHY能够相互作用,而且这种相互作用不受光的影响。酵母双杂交实验以及双分子荧光互补实验都验证了这一相互作用。染色质免疫共沉淀实验表明,与野生型相比,在35S::WRKY10转基因植物中,CCA1/LHY结合PIF4启动子的强度增强,拟南芥叶片原生质体转录激活实验也证明这一结论;另外体外凝胶阻滞迁移实验显示,在CCA1/LHY结合PIF4启动子的体系中加入WRKY10蛋白,结果显示随着WRKY10蛋白量的逐渐增多,CCA1/LHY的结合条带逐渐增强,并且发生滞后效应。说明WRKY10能够促进CCA1/LHY结合PIF4启动子,揭示了WRKY10和CCA1/LHY相互作用的生物学意义。(4)WRKY10通过CCA1/LHY与SHB1形成复合体,并且SHB1反馈调节WRKY10的表达。免疫共沉淀实验表明当CCA1/LHY存在时,WRKY10和SHB1存在相互作用,而CCA1/LHY不存在时,WRKY10和SHB1不能发生相互作用,说明WRKY10和SHB1存在间接相互作用,即WRKY10和CCA1/LHY以及SHB1形成复合体,共同调控PIF4的表达。而且,SHB1可以关联至WRKY10基因,促进WRKY10的表达。(5)WRKY10依赖于CCA1/LHY发挥功能。在红光条件下,pWRKY10::WRKY10-MYC/Ws转基因植物下胚轴比野生型长,而pWRKY10::WRKY10-MYC/cca1 lhy转基因植物下胚轴长度和cca1 lhy双突变体相比并无明显差异。而且与野生型相比,pWRKY10::WRKY10-MYC/Ws转基因植物中PIF4基因表达量上调,但pWRKY10::WRKY10-MYC/cca1 lhy转基因植物和双突变体cca1 lhy中PIF4基因的表达量并无明显差异,说明WRKY10依赖于CCA1/LHY促进PIF4基因的表达。综上所述,WRKY2和WRKY10为同源基因,共同参与调控植物的光形态建成过程,在光下结合PIF4基因启动子并增强CCA1/LHY结合PIF4启动子,以招募更多的SHB1蛋白促进PIF4基因的表达,另外,SHB1又可关联至WRKY10基因并促进其表达,从而形成调节环,以削弱植物在强光照条件下的光响应,避免强光照对植物造成损伤,维持植物光形态建成的平衡态。