帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,以肌强直、肢体震颤和运动减少等症状为主要临床表现。其主要病理特征为黑质(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine, DA)能神经元的缺失和细胞内路易小体(Lewy bodies, LBs)的形成。我国65岁以上的人群PD的患病率为1.7%,随着我国社会经济的发展和老龄化社会的加剧,PD的发病率势必进一步攀升。但是由于该病的确切病因和发病机制尚不清楚,使之无法从根本上预防和治疗PD并延缓其进展,因此,深入探讨PD的发病机制无疑对推动PD的防治具有重要的科学意义。铁在PD的发病过程中起着关键的作用,过量的游离铁,特别是Fe2+可以通过Fenton反应形成羟自由基(hydroxyl radical, OH·),而Fe3+则可以通过Haber-Weiss循环还原成Fe2+进而生成OH.。OH·通过损伤蛋白质、核酸、和含有大量未饱和脂肪酸的细胞膜,最终导致细胞死亡。目前已有大量证据表明alpha-突触核蛋白在PD的发病机制中起到重要的作用。Alpha-突触核蛋白的过量表达可以导致其聚集体的形成并对细胞产生毒性。神经病理学研究发现以alpha-突触核蛋白异常聚集为主要病理变化的多种突触蛋白病往往伴有铁的堆积,说明铁与alpha-突触核蛋白聚集之间存在一定联系。另有实验证实Fe2+和Fe3+可在体外及细胞内促进alpha-突触核蛋白的聚集。最近,人们在alpha-突触核蛋白的5’端未翻译区(untranslated region, UTR)发现了类铁反应元件(iron responsive element, IRE),这一发现为铁可能通过增加alpha-突触核蛋白的表达导致DA能神经元的死亡提供了依据。为了探讨铁诱导alpha-突触核蛋白聚集的机制,本实验应用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法,流式细胞术(flow cytometry, FCM),硫磺素S和荧光双标记,逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及免疫印迹等多种实验方法,在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中观察抗氧化剂维生素E(vitamin E, VE)对铁诱导的细胞损伤和alpha-突触核蛋白聚集情况的变化,探讨铁诱导的氧化应激与alpha-突触核蛋白聚集之间的关系；构建含有alpha-突触核蛋白mRNA 5’-UTR类IRE的质粒alpha-synuclein-IRE-Luc,应用双荧光素酶检测(dual Iuciferase reporter assay)的方法在HEK293细胞中探讨其是否是功能性的铁反应元件,并在SK-N-SH细胞中证实铁可以通过铁调节蛋白(iron regulatory proteins, IRPs)-IRE系统调节alpha-突触核蛋白的表达。结果如下：1、1 mmol/L Fe2+和Fe3+处理SK-N-SH细胞24 h,细胞存活率下降,细胞内活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)生成增加,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)；细胞内alpha-突触核蛋白的聚集较对照组明显增多；2、5μmol/L VE与1 mmol/L Fe2+或1 mmol/L Fe3+共孵育SK-N-SH细胞24 h可以完全抑制铁诱导的ROS生成和细胞存活率的下降；5μmol/L VE能部分但不能完全阻断细胞内alpha-突触核蛋白聚集,提示氧化应激部分参与了铁诱导的alpha-突触核蛋白聚集；3、成功构建了携带alpha-突触核蛋白mRNA 5’-UTR类IRE的alpha-synuclein-IRE-Luc荧光素酶报告载体,应用双荧光素酶检测系统在HEK293细胞中检测插入的类IRE在转录后水平上的调节；同时构建了携带Ferroportinl mRNA 5’-UTR IRE的Ferroportin 1-IRE-Luc荧光素酶报告载体作为阳性对照；4、1 mmol/LFe3+孵育HEK293细胞可使alpha-synuclein-IRE-Luc转染组荧光素酶的表达上调,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)；100μmol/L去铁胺(deferoxamine mesylate, DFO)孵育HEK293细胞则alpha-synuclein-IRE-Luc转染组荧光素酶的表达下调,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P<0.05),提示此类IRE具有铁反应性；5、IRP1的干涉载体pSilencerl.0-U6-IRP1与荧光素酶报告载体pRL-TK, alpha-synuclein-IRE-Luc共转染HEK293细胞,降低细胞内IRP1表达水平后alpha-synuclein-IRE-Luc转染组荧光素酶的表达上调,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)；而IRP1的高表达载体pCMV6-AC-ACO1与pRL-TK, alpha-synuclein-IRE-Luc共转染HEK293细胞增加细胞内IRP1表达后则可下调荧光素酶的表达,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P<0.05),提示插入的类IRE受细胞内IRP表达水平的调节；6、pSilencerl.0-U6-IRP1转染SK-N-SH细胞后可使细胞内alpha-突触核蛋白mRNA和蛋白水平均增加,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05),同时转染后细胞内alpha-突触核蛋白的聚集较对照组明显增多。上述实验结果表明：细胞内铁水平可以通过氧化应激途径诱导SK-N-SH细胞内alpha-突触核蛋白聚集体的形成,VE完全阻断氧化应激后并未完全缓解alpha-突触核蛋白的聚集,提示氧化应激仅部分参与了铁诱导alpha-突触核蛋白聚集；构建的alpha-synuclein-IRE-Luc荧光素酶报告载体的转录受细胞内铁水平和IRP1表达水平的调控,提示alpha-突触核蛋白5’-UTR区的类IRE是一个功能性元件；细胞内的铁可以通过IRE/IRP系统调控alpha-突触核蛋白的表达。本研究结果表明铁可以通过氧化应激和IRE/IRP调控系统增加alpha-突触核蛋白的表达,诱导alpha-突触核蛋白聚集,继而导致DA能细胞的损伤和死亡。本研究将为铁和alpha-突触核蛋白相互作用参与PD发病提供更加详实可信的资料,并为药物治疗提供新的作用靶点。