NAC转录因子属于植物特异的转录因子大家族成员,在植物的生长发育、响应生物与非生物逆境胁迫、激素信号转导等过程具有重要的作用。目前,拟南芥与其它作物中一些NAC转录因子的功能已经被广泛报道了,但对其作用机制和调控网络尚待完善;同时,NAC家族中很多未被报道的其它成员的功能依旧需要去探索和发现。类钙调磷酸酶B蛋白（Calcineurin B-Like,CBL）是植物中特有的钙传感器家族,通过感知钙离子的信号调节一个SNF1相关激酶家族蛋白的活性,也称为CBL相互作用蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase,CIPK）,然后将信号进一步传递下去。在高等植物中,CBL-CIPK网络代表了各种钙离子响应的一种解码机制。目前,CBL-CIPK对非生物胁迫与离子稳态的研究取得了显著的进展,但是在调控激素信号的研究领域,特别是ABA信号网络,依旧存在很多的疑问尚待解析。本研究对拟南芥中一个NAC基因以及油菜中的一个CIPK基因进行了功能与调控机制的分析。1.前期的研究工作发现拟南芥的At NACw在烟草叶片中的异源表达会引起大量的活性氧（ROS）累积、相对电导率的升高,产生叶片坏死的表型;通过酵母转录活性分析发现At NACw编码一个转录激活型蛋白。在此基础上,本研究首先通过融合绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）标签,观察到At NACw-GFP定位于细胞核内;GUS组织化学染色显示At NACw主要在侧根和花芽中表达;不同激素和逆境处理下的检测数据显示,At NACw受脱落酸（abscisic acid,ABA）以及盐害（Na Cl）的诱导表达。除此之外,在叶龄依赖的叶片衰老过程中,At NACw的过表达株系会促进衰老的进程,伴随着叶绿素含量的降低,相对电导率升高等变化;atnacw突变体有轻微的延缓衰老的表型。此外,At NACw-SRDX显性抑制株系也呈现出衰老进程延缓的表型。与过表达株系的表型一致的是,At NACw的三个诱导性过表达株系在雌二醇的诱导之后也加快了衰老的进程。为了解析At NACw调控衰老的分子机理,通过q RT-PCR,筛选了At NACw的过表达株系、突变体株系、GFP对照株系之间差异表达的基因,结果显示NYC1,NYE2,BFN1,SAG29,SAG12,αVPE等基因在过表达株系中上调,在突变体株系中下调。继而,进行了双荧光素酶报告分析（Dual-LUC）试验,结果显示,At NACw能够转录激活多个与叶绿素降解相关的基因的启动子,例如Pro NYC1、Pro NYE1、Pro PAO等;同时,At NACw能够激活细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）相关基因的启动子,比如Pro BFN1、Pro CEP1、Pro MC9、ProαVPE、ProδVPE等。通过体外的凝胶迁移（EMSA）技术,对这些潜在的靶基因进行了检测与验证,发现At NACw转录因子能够与这些靶基因的启动子区域的特定片段结合。综上所述,本研究表明At NACw是一个与PCD、衰老密切相关的转录因子,以转录激活子形式发挥作用,能够响应ABA与盐害的处理,通过转录激活PCD与衰老相关的基因从而参与了拟南芥叶片衰老的调控过程。2.通过利用qRT-PCR技术,检测了多种激素或逆境条件下的Bna CIPK3的表达水平变化,发现其显著受到ABA和冷害的诱导表达,同时也受到水杨酸（Salicylic acid,SA）的诱导表达。通过亚细胞定位,发现Bna CIPK3-GFP能够在细胞质与细胞核定位。通过双分子荧光互补技术鉴定Bna CIPK3可以和多个Bna CBL发生互作,其中Bna CIPK3与Bna CBL-1、-3、-4、-8、-9的互作较强,这一结果跟之前本实验室通过酵母双杂交鉴定的结果基本一致。然后,通过酵母双杂交与双分子荧光互补技术,发现Bna CIPK3可以与ABA受体家族的Bna PYR1与PYL8互作;与PP2C家族的Bna HAB1和Bna HAB2互作;同时与Bna ABF3/4转录因子存在互作。免疫共沉淀技术进一步验证了Bna CIPK3与Bna ABF3/4的互作。后续的体外磷酸化实验表明,Bna CIPK3可以磷酸化Bna ABF3/4,并且对Bna ABF3的磷酸化更显著。最后,使用双荧光素酶报告基因系统,检测Bna CIPK3磷酸化Bna ABF3后对其转录活性的影响,结果显示,磷酸化的Bna ABF3对下游基因RD29B启动子有显著的激活作用。总之,本研究在甘蓝型油菜中鉴定了一个新的调控ABA信号的CIPK,拓展了对CIPK家族成员功能与调控机制的认识,为更好地通过分子辅助的育种手段改良作物的抗逆性提供了理论与技术储备。