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噬菌体T7 RNA聚合酶结构简单,是分子量仅为100 kD的单亚基酶,而且是目前已知的转录活性最高RNA聚合酶。另外,T7噬菌体启动子属于组成型的强启动子,具有严格的启动子特异性,不会与宿主细胞的基因转录相互干扰。所以,基于T7 RNA聚合酶及其启动子的偶联表达系统,不但在体外RNA合成及大肠杆菌外源蛋白合成中得到了广泛应用,还同样地被应用于真核细胞,提高目的基因的表达水平。但是,T7 RNA聚合酶自身的表达往往依赖重组痘苗病毒载体,导致产物中含有没有去除的痘苗病毒。在本课题中,利用基本的分子生物学元件,如CMV启动子、T7启动子、和内部核糖体进入位点（IRES）等,我们组装了一个T7 RNA聚合酶的正反馈表达系统。为验证这个正反馈系统,我们构建了由T7启动子调控的报告基因,绿色荧光蛋白和荧光素酶的表达质粒。通过实时定量PCR方法、共聚焦显微镜、细胞流式技术和双荧光素酶活力检测,我们将验证T7 RNA聚合酶正反馈回路在真核细胞的表达。此外,在另一项研究中,我们构建了T7启动子调控的慢病毒载体,并将检验T7 RNA聚合酶正反馈表达回路对慢病毒载体滴度的影响。研究内容和研究方法1.首先,构建一个能在真核细胞表达T7RNA聚合酶（T7RNP）的载体质粒。我们是以pEGFP-N1载体为基础构建这个质粒的。首先通过PCR克隆T7RNP基因,将其连接到pGM-T载体上,在测序验证序列正确的基础上,我们通过单酶切的方式将其连接到pEGFP-N1的CMV启动子的后面,然后通过酶切验证连接进去的T7RNP的方向,挑取正确的克隆。这样就构建一个能被真核细胞识别,并启动T7RNP表达的载体质粒。我们将这个质粒命名为pCMV—T7RNP。2.通过构建T7RNP与EGFP融合蛋白来验证T7RNP在真核细胞内的翻译与定位。我们先用KpnI和SmaI酶切构建好的pCMV—T7RNP质粒,目的是切去T7RNP基因的终止子序列,然后重新连接这个载体,实现T7RNP与EGFP蛋白阅读框的正确连接。这样就构建了一个能表达T7RNP和EGFP融合蛋白的新质粒（pCMV—T7RNP/EGFP）,用该质粒来转染细胞,观察荧光的出现与位置。3.定量检测T7RNP的转录水平。我们用pCMV—T7RNP载体转染293FT细胞,利用T7RNP的特异性引物与探针,通过实时定量RT-PCR的方法检测T7RNP的表达,以确定一般情况下核内转录T7RNP的水平,并通过多组实验筛选一个合适的转染时间和转染剂量。4.构建由T7启动子调控的T7RNP表达质粒。为此,我们以pET28a载体为基础,在多克隆位点通过单酶切的方式插入一个T7RNP基因（pT7—T7RNP）,验证插入的方向是否正确,取正确的克隆,然后在T7启动子和T7RNP之间插入内部核糖体进入位点（IRES）序列,这样就构建了一个由T7启动子控制的T7RNP真核表达载体。我们将此质粒命名为pT7—IRES—T7RNP.5.检测正反馈回路中T7RNP的转录水平。我们将pCMV—T7RNP或分别与pT7—T7RNP及pT7—IRES—T7RNP质粒共同转染293FT细胞,通过实时定量RT-PCR的方法检测T7RNP的表达。正反馈的实现依赖于IRES的存在,因此,质粒pT7—T7RNP可用来验证正反馈回路组装成功与否。6.利用绿色荧光蛋白EGFP为报告基因来测量正反馈回路中EGFP的蛋白水平。以pGL3-Basic载体为基础,我们首先构建由CMV启动子和T7启动子调控的EGFP质粒,分别命名为pCMVEGFP和pT7IRESEGFP。将这些质粒分别与正反馈的T7RNP质粒共转染293FT细胞。利用细胞流式仪及激光共聚焦定量检测EGFP的表达。7.利用荧光素酶Luc为报告基因来检测正反馈回路中荧光素酶的活力水平。以pGL3-Basic载体为基础,我们首先构建由CMV启动子和T7启动子调控的Luc质粒,分别命名为pCMVLuc和pT7IRESLuc。将这些质粒分别与正反馈的T7RNP质粒共转染293FT细胞。利用双荧光素酶法定量检测荧光素酶的活力。8.我们还将验证T7RNP正反馈系统能否提高慢病毒的滴度。我们首先构建由T7启动子调控的慢病毒转移质粒、包装质粒、和包膜质粒,分别命名为pT7LentiEGFP、pT7IRESGag/Pol、和pT7IRESVSVG。将这些质粒与T7RNP正反馈系统共同转染293FT细胞,检测慢病毒的RNA滴度、DNA滴度、和转染滴度。对照慢病毒系统命名为pRSVLentiEGFP。研究结果:1.通过PCR克隆了T7RNP基因,并且将此基因连接到了pGM-T载体,测序结果表明我们克隆的T7RNP基因的碱基没有突变产生。2.通过HindⅢ的单酶切反应,我们将含有T7RNP基因的片段连接到了pEGFP-N1载体,酶切验证结果正确。完成pCMV—T7RNP的构建。3.成功构建T7RNP和绿色荧光蛋白的融合蛋白,确认T7RNP在真核细胞内的翻译与胞浆中的定位。4.用高纯度的pCMV—T7RNP转染293FT细胞,提取总RNA,然后通过实时定量RT-PCR的方法检测到细胞内T7RNP基因的表达。没有反转录的反应作为阴性对照。5.通过酶切的方式,我们将T7RNP基因和IRES连接到pET28a载体上,成功地构建了T7启动子调控表达的T7RNP载体:pT7—IRES—T7RNP.6.通过酶切与合成的方式,以pGL3-Basic载体为基础,成功地构建了由CMV启动子和T7启动子调控的EGFP质粒:pCMVEGFP和pT7IRESEGFP。7.通过酶切与合成的方式,以pGL3-Basic载体为基础,成功地构建了由CMV启动子和T7启动子调控的Luc质粒:pCMVLuc和pT7IRESLuc。结论通过一系列的步骤,我们构建了多个与表达T7RNP相关的载体,用这些载体去转染293FT细胞,表明T7RNP正反馈回路可以在真核细胞中建立,为后续的慢病毒载体的制备工作做出了很好的铺垫。