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目的感音神经性聋是耳科学领域难点及热点问题。内耳螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)的凋亡是导致感音神经性聋的主要因素之一,促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)被认为在脑、脊髓等中枢神经系统广泛表达并具有神经保护作用,但在大鼠内耳是否表达,以及对内耳SGNs是否具有神经保护作用则不清楚。探讨EPO在大鼠内耳螺旋神经元兴奋毒性损伤中的作用及相关机制,为SGNs的兴奋毒性损伤保护提供新的理论。材料与方法1、通过免疫组织化学、荧光激光共聚焦扫描荧光显微镜技术明确EPO在内耳中有无表达情况。2、分离大鼠耳蜗及体外培养SGNs并鉴定。3、采用不同浓度谷氨酸(0,10,25,50,75,100μmol/L)分别作用于培养48小时的螺旋神经元,MTT、TUNEL法分别检测SGNs的细胞活力、细胞凋亡。4.构建重组腺病毒载体Ad-EPO并转染到体外培养的SGNs,选择0,20,50,100,150,250PFU的不同感染复数(MOI)及24h,48h和72h的不同感染时长,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)表达检测感染率,确定最佳感染倍数和病毒表达时间。5.分别经RT-PCR、Western Blot检测Ad-EPO感染SGNs后细胞中EPO的mRNA和蛋白表达水平。体外培养细胞经谷氨酸处理后,分别用MTT、TUNEL法和Caspase-3法检测转染腺病毒Ad-EPO的SGNs的细胞活力、细胞凋亡情况。6.构建靶向EPO基因重组shRNA表达载体pGenesil-EPO并将EPO siRNA转染到SGNs。检测干扰载体感染细胞后EPO的mRNA及蛋白表达水平;检测在谷氨酸兴奋毒性损伤环境下,经干扰载体感染后的螺旋神经元的细胞活性和凋亡情况。7、采用荧光定量PCR和Westernblot方法分别测定PI3K/Akt信号通路中的pAKT、FOXO3a、GSK-3β相对表达水平变化,分析PI3K/Akt信号通路是否参与在EPO对Glu所致兴奋毒性损伤的SGNs神经保护中的调控机制。结果1、EPO及EPO-R在大鼠内耳中SGNs、血管纹、Corti器中均有表达,主要位于细胞膜、胞浆与胞质。2、SGNs在24-48小时后多数呈典型双极神经元,胞体椭圆形或圆形,突起细长,其长度常为胞体数倍。NSE行免疫荧光化学鉴定,可在荧光显微镜下见到神经元的胞体及突起呈红色荧光,胞核明显,少数仅胞体显示有荧光。3、MTT检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡,与对照组相比,50、75、100μmol/L组的活性与对照组比较明显下降,差异有显著意义(P<0.01)。凋亡率与对照组比较明显上升,差异有显著意义(P<0.01)。4、成功构建重组腺病毒Ad-EPO。Ad-EPO感染SGNs48h、MOI 150时Ad-EPO感染效率与GFP阳性反应趋于稳定平台期,确定感染倍率为MOI 150、感染48小时为时相点。5、免疫荧光检测EPO在部分螺旋神经元中表达,红色荧光为阳性表达。Ad-EPO转染细胞48h后,EPO的mRNA、蛋白表达明显升高,转染组与对照组比较差异有显著意义(P<0.05)。提示转染腺病毒载体后的EPO在螺旋神经元中过表达。谷氨酸浓度为50,75,100μmol/L组,经腺病毒转染后的细胞活性,与对照组相比,Ad-EPO转染组中细胞活性明显提高,差异有显著意义(P<0.05)。提示腺病毒转染后,可以拮抗谷氨酸造成的损伤影响。TUNEL法对细胞凋亡率检测的结果提示,Glu浓度为50,75,100μmol/L组,Ad-EPO转染组的细胞凋亡率明显下降,差异有显著意义(P<0.01)。Caspase-3法得到相似结果。提示转染EPO腺病毒后,可以有效抑制其兴奋性损伤中细胞凋亡。6、构建靶向EPO重组shRNA表达载体pGenesil-EPO,并成功将EPO siRNA转染到体外培养的螺旋神经元中,转染干扰载体后,下调了螺旋神经元中的EPO表达水平,Glu浓度为50,75,100μmol/L组中,与对照组相比,EPO siRNA组细胞活性、凋亡率均分别差异有非常显著意义(P<0.01)。Caspase-3法检测结果类似。结果提示转染RNA干扰病毒载体后,EPO下调表达,进一步加重了细胞活性下降及SGNs兴奋毒性所致凋亡。7、采用荧光定量PCR和Westernblot方法测定pAKT、FOXO3a、GSK-3β等几个主要分子表达,通过抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt信号通路加重这种损伤,表明该信号通路参与了Glu对SGNs的损伤调控。转染Ad-EPO后,上调了SGNs细胞内的EPO表达水平,对Glu造成的螺旋神经元损伤可以获得保护效应。此时pAKT、FOXO3a、GSK-3β等几个主要分子的表达发生逆转,并可以拮抗LY294002进一步加重的Glu所致兴奋毒性损伤。结论1、EPO及EPO-R在大鼠内耳中SGNs、血管纹、Corti器中均有表达,主要位于细胞膜、胞浆与胞质。2、成功培养大鼠SGNs并鉴定证实,确定损伤的最适Glu浓度及作用时间,同时检测其细胞相关活性与凋亡指标,成功构建了谷氨酸所致兴奋毒性损伤的体外模型。3、构建EPO重组腺病毒载体的并转染到体外培养的大鼠SGNs中,证明外源性腺病毒基因转染上调EPO蛋白表达对兴奋毒性损伤所致螺旋神经元的凋亡有神经保护作用。4、构建靶向EPO重组shRNA表达载体pGenesil-EPO,并成功将EPO siRNA转染到体外培养的螺旋神经元中,下调了螺旋神经元中的EPO表达水平,加重SGNs因兴奋毒性损伤导致的凋亡。5、测定PI3K/Akt信号通路中主要分子相对表达水平变化,结果提示PI3K/Akt信号通路参与了EPO对谷氨酸所致螺旋神经元兴奋毒性损伤的神经保护作用调控机制。