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猪防御素是近些年来发现的广泛存在于猪体内的一类抗菌肽,具有广谱高效的杀菌活性,细菌对其不易产生耐药性。因此,利用猪防御素作为传统抗生素的替代物,具有极大的潜力。其中猪β防御素2(pBD-2),发现时间较晚,且天然的pBD-2资源有限,所以目前国内外对其作用机理的研究报道较少。而大量研究表明,防御素抑制杀灭细菌的特殊作用机理是其不易使细菌产生耐药性的重要原因之一。因而,为了探明猪β防御素2的抑菌机理,本试验利用基因差异表达技术体外检测与pBD-2共培养的大肠杆菌内源性基因的表达差异,初步探究猪β防御素2抑制革兰氏阴性菌生长的潜在作用机理。具体的研究内容如下:1、利用本实验室前期已经构建的携带猪β防御素2的工程菌株BL21-pET30a-pBD-2,进行诱导表达。通过SDS-PAGE分析目的蛋白的分子量,经过超声波破碎,镍离子柱亲和层析纯化得到融合蛋白,检测纯度达到95%以上。蛋白纯化后进行抑菌试验分析,结果显示,pBD-2对大肠杆菌有明显的抑杀作用。2、在上述试验的基础上,选择浓度150μg/ml的pBD-2与大肠杆菌(E.Coli ATCC 25922标准菌株)共培养一定时间(1h和4h)。分别提取菌体总RNA,然后利用GenefishingTMRT-PCR差异表达检测试剂盒,对与pBD-2共培养不同时间的大肠杆菌差异表达基因进行检测,并进一步筛选差异表达基因进行克隆测序。结果发现大肠杆菌与pBD-2共培养1h,发现差异表达条带共计12个,切胶回收后,成功克隆和测序片段7个;与pBD-2共培养4h,发现差异表达条带18个,切胶回收后,成功克隆和测序片段9个。3、利用半定量PCR及荧光定量PCR技术,进一步检测筛选得到的差异表达片段的表达丰度。结果最终确定:与pBD-2共培养1h,大肠杆菌中确定的差异表达片段为3个;与pBD-2共培养4h的大肠杆菌中确定差异表达条带5个。4、利用荧光定量PCR筛选得到的差异表达片段的序列,进行生物信息学分析,结果表明:本研究所得的差异表达片段,均能找到高度同源的已知基因。其中与pBD-2共培养1h,大肠杆菌中确定的表达差异的基因3个,分别是转移-信使RNA(1OSaRNA)(下调)、调控RNA的CsrB家族(regulatory RNA CsrB)(上调)、乳糖操纵子阻遏因子(Lactose operon repressor/lactose-inducible lac operon transcriptional repressor)(下调);与pBD-2共培养4h,大肠杆菌中表达差异基因5个,分别为海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase)(下调)、一种假设蛋白(Hypothetical protein)(下调)、钾离子转运ATP酶亚单位B(potassium transporting ATPase subunit B)(上调)、磷酸组氨酸磷酸酶(phosphohistidine phosphatase)(下调)、另一种假设蛋白(Hypothetical protein)(下调)。其中大肠杆菌与pBD-2共培养1h发现的差异表达基因大多属于调控基因,大肠杆菌与pBD-2共培养4h发现的差异表达基因大多数属于表达功能蛋白的基因,这可能与pBD-2抑菌程序有关。而这些差异表达基因中,表示pBD-2抑菌作用有阻碍蛋白质或酶的合成、参与细菌DNA或RNA的调控、增强细菌细胞膜的通透性、阻碍细菌细胞壁或细胞膜的合成等,后续试验需进一步验证。本试验通过对不同共培养时间的大肠杆菌中差异表达基因的检测,发现猪β防御素2能够导致大肠杆菌内源性基因表达丰度的改变。为进一步阐明猪β防御素2抑制革兰氏阴性菌生长的潜在作用机理,以及其在猪病防治中的应用奠定一定基础。