神经元凋亡是由基因调控的、按既定信号转导通路进行的程序性死亡。一方面，神经元凋亡在中枢神经系统的正常发育过程中起着关键作用。另一方面，神经元凋亡导致的神经元丢失是许多中枢神经系统退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)、帕金森病(Parkinson’S disease，PD)、肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和亨廷顿病(Humington’s disease)的主要病理特征，也与各种因素引起的脑缺血损伤密切相关。所以寻找各种阻止神经元凋亡的措施并对其机制进行深入探讨对于此类疾病的防治具有重要意义。 本研究以低钾诱导的CGN凋亡模型为研究对象，探讨热预处理抗神经元凋亡作用及信号转导机制，并以腺病毒为载体过表达诱导型HSP70，观察其对低钾诱导的CGN凋亡的作用，为诱导型HSP70在热预处理抗神经元凋亡中的作用提供直接的证据。同时对在热预处理诱导的神经保护作用中，HSP70和各信号转导通路之间的关系进行了初步探讨。 第一章热预处理对低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用 本研究以低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型为研究对象，探讨热预处理抗神经元凋亡作用，以便进一步探讨其信号转导机制。 方法小脑颗粒神经元的分离培养；体外培养8 d的小脑颗粒神经元分为3组：正常对照组(25K组)：去掉原培养基，更换成含25 mmol／L KCl的无血清培养基；低钾组(5K组)：去掉原培养基，更换成含5 mmol／L KCl的无血清培养基；热预处理(H+5K组)：去掉原培养基，更换成25 mmol／L KCl的无血清培养基，先行90min、43.5℃热预处理，37℃恢复1h，再将培养基换成5mmol/LKCl的无血清培养基。低钾24h后观察。二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)染色检测神经元的存活率(Viability)；Hoechst33258染色观察神经元核及染色质的形态变化；琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)检测神经元DNA的片段。 结果 与正常对照组比，低钾组神经元存活率降为35.7％±5.0％(p＜0.01)；Hoechst 33258核染色可见较多凋亡的细胞核；琼脂糖凝胶电泳可见细胞凋亡的典型生化特征-DNA梯状条带。与低钾组比较，热预处理组神经元存活率增加为93.1％±4.0％(p＜0．01)；Hoechst 33258核染色出现的凋亡的细胞核明显减少；琼脂糖凝胶电泳不再出现DNA梯状条带。 结论 90 min的43.5℃的热预处理明显抑制了低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡。 第二章热预处理抗低钾诱导的小脑颗粒神经元 凋亡的信号转导机制 上一部分的研究表明：热预处理抑制了低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。本部分我们拟从信号转导的角度对热预处理抗神经元凋亡的机制进行研究。PI3K／Akt通路是一条经典的促存活通路，介导了多种神经元的存活。在小脑颗粒神经元中，许多促存活的因子如IGF、BDNF等都是通过激活P13K／Akt通路而发挥其抗神经元凋亡的作用。MAPK家族在神经元存活／凋亡中起着重要的调节作用，其中JNK／c-Jun或p38／c-Jun通路被认为是介导神经元凋亡的重要通路，有研究证明了c-Jun的磷酸化为低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡所必需。因此，本部分中我们着重探索了PI3K／Akt通路和c-Jun在热预处理抗低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中的作用。 方法 小脑颗粒神经元的分离培养及凋亡检测同第一部分；热预处理的方法同第一部分；蛋白免疫印迹(western blot)法分别检测磷酸化Akt和磷酸化GSK3β水平及总Akt水平；逆转录一聚合酶链反应(reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR)观察c-jun基因的表达水平；Westem blot法检测c-Jun蛋白和磷酸化c-Jun的水平，并检测c-Jun上游激酶JNK、p38的活性的变化。 结果 热应激能依赖PI3K诱导小脑颗粒神经元Akt和GSK3β的磷酸化，使磷酸化Akt和磷酸化GSK3β的水平增高。PI3K的特异性阻断剂，Ly294002和Wortmannin都可以明显地抑制热预处理对小脑颗粒神经元的保护作用：使神经元存活率重新降低；Hoechst 33258核染色重新出现较多凋亡的细胞核；琼脂糖凝胶电泳重新可见细胞凋亡的典型生化特征-DNA梯状条带。热预处理引起的Akt和GSK3β磷酸化水平的增高在低钾过程中持续存在，Ly294002和Wortmannin则明显抑制了低钾过程中热预处理引起的Akt和GSK3β的磷酸化。c-jun基因在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的过程中被上调，c-Jun蛋白亦被上调且活性明显增加，其上游激酶JNK活性保持不变，而上游激酶p38的活性增加，热预处理可以明显抑制低钾过程中c-jun基因的上调、c-Jun蛋白水平的增加及c-Jun蛋白活性的增加，也抑制了低钾过程中p38活性的增加。 结论 PI3K/Akt通路参与了热预处理对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用；热预处理也可能通过抑制低钾过程中c-Jun的激活和表达而对神经元产生保护作用，该抑制作用可能通过抑制p38的活性而产生。 第三章 腺病毒介导的诱导型HSP70的过表达对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的影响 本课题组的前期研究表明热预处理诱导了小脑颗粒神经元中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的产生。但HSP70的表达是否具有抗低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用呢?目前还缺乏直接的证据。本部分我们采用腺病毒为载体于CGN内过表达人诱导型HSP70，观察其对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用。 方法 人胚胎肾293细胞(human embryonic kidney 293，HEK 293)的复苏、培养及传代；腺病毒在HEK293细胞中感染及扩增；收集扩增后的腺病毒行CsCl密度梯度超速离心；腺病毒的纯化及浓度的检测；小脑颗粒神经元(CGN)的分离和培养；原代培养5d的CGN共感染含人诱导型HSP70和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒(AdTR5/HSP70-GFP)和四环素调控的启动子(AdCMV/tTA)，或共感染含GFP的腺病毒(AdTR5/GFP)和四环素调控的启动子AdCMV/tTA(对照组)。48h后，采用细胞荧光免疫组织化学法、Western blot法检测HSP70的表达，或者换成无血清含5 mmol／L KCl的培养基以诱导神经元凋亡。24 h后，采用相差显微镜观察细胞形态学变化，MTT法检测神经元存活率，Hoechst33258核染色和DNA琼脂糖凝胶电泳分析神经元凋亡，以观察HSP70过表达对低钾诱导的CGN凋亡的影响。 结果 共感染了AdCMV／tTA和AdTR5／HSP70-GFP的CGN过表达了HSP70，抑制了低钾诱导的CGN的凋亡：使神经元存活率由45.5％±5.2％提高至82.3％±5.2％(P<0.01)，核固缩减少，DNA的片段化减轻。 结论腺病毒介导的人诱导型HSP70的过表达抑制了低钾诱导的CGN凋亡。 第四章热预处理神经保护过程中HSP70和各信号 转导通路之间关系的初步探讨。由以上研究结果，可知：在CGN中，热预处理既能激活P13K／Akt通路，也能诱导HSP70的表达，并且激活的P13K／Akt通路和HSP70的过表达都可以抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡；那么，在热预处理的神经保护作用中，它们之间的关系如何?我们进行了初步探讨。利用P13K的特异性阻断剂Ly294002来研究热诱导的HSP70的产生是否由P13K／Akt通路的激活介导；利用HSP70的特异性阻滞剂KNK437来研究热应激激活的P13K／Akt通路是否由HSP70介导、热预处理对CGN低钾过程中Akt的激活、c-Jun活性的抑制作用是否由于HSP70的作用。 方法：小脑颗粒神经元的分离与培养、神经元存活率的检测、热预处理的方法同第一章；采用Western blot法检测HSP70、磷酸化Akt和磷酸化c-Jun的水平。 结果：热应激可以时间依赖性地诱导HSP70的产生，但是Ly294002对热预处理诱导HSP70的表达水平没有明显影响；KNK437，热休克蛋白70(HSP70)的特异性抑制剂，在抑制热诱导产生的HSP70的同时，也抑制了热诱导的磷酸化Akt的水平；KNK437可以剂量依赖性地抑制热预处理的神经保护作用；提取小脑颗粒神经元低钾处理后3 h的蛋白行Western blot分析，发现：KNK437既抑制了热引起的HSP70的水平，也抑制了热诱导的磷酸化Akt水平；热预处理抑制了低钾引起的磷酸化c-Jun的增高，而KNK437在抑制了热诱导的HSP70水平的同时，也逆转了热预处理对磷酸化c-Jun的抑制作用，使低钾后磷酸化c-Jun的水平重新增高。 结论：热预处理对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的抑制作用可能是：热诱导的HSP70通过激活P13K／Akt通路和抑制c-Jun的活性产生。