背景:肺癌是人类最常见的呼吸系统恶性肿瘤,发病率和死亡率均居所有肿瘤之首,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最为常见的病理组织类型。NSCLC治疗方法主要包括手术、放化疗、靶向性药物治疗、免疫治疗。手术是NSCLC最佳的根治性治疗方法,然而大部分NSCLC患者诊断时即为晚期,已失去最佳手术时期,不能接受根治手术。放化疗是目前中晚期NSCLC的主要手段,但多数患者的放化疗效果仍十分不佳。靶向性药物治疗能够提高患者的生存率,但适应征窄、易耐药、费用高等缺点也限制了其临床应用。免疫疗法作为新的治疗手段,但目前疗效仍十分不确切。研究已证实天然中药单体及其类似物具有抗肿瘤作用,是抗肿瘤药物的重要来源之一。灯盏花素是灯盏花的主要提取成分,具有广泛的药理作用如:抗氧化、抗炎、血管保护等作用。近年来,研究证实灯盏花素具有抗肿瘤活性,但其在肺癌中的作用及其分子机制仍未完全明确,值得进一步研究。目的:利用体外细胞系和体内移植瘤模型,分析灯盏花素对NSCLC细胞增殖、凋亡以及移植瘤生长的影响,明确其抗肿瘤作用。重点关注灯盏花素对小分子RNA-7(microRNA-7,miRNA-7)和胰岛素样生长因子结合蛋白家族4(insulin-like growth factor binding protein 4,IGFBP-4)的表达影响,并观察过表达或者沉默miRNA-7和IGFBP-4在灯盏花素抗NSCLC中的作用,阐明灯盏花素抗NSCLC的分子机制。方法:1、用MTT细胞增殖实验、Trypan blue死亡细胞染色方法检测肺癌细胞A549、NCL-H460和正常肺纤维细胞MRC-5增殖改变,分析灯盏花素对NSCLC细胞的选择性杀伤作用。2、用Annexin V/PI双染细胞凋亡检测方法、caspase-3活性试剂盒、Western blot、细胞周期检测试剂盒检测A549细胞凋亡、caspase-3活性及促凋亡和抗凋亡蛋白的表达以及细胞周期的改变,分析灯盏花素对肺癌细胞凋亡和周期阻滞作用。3、用0、25、50、100 μM灯盏花素处理A549细胞48 h,用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、活性氧(ROS)检测试剂盒检测A549细胞线粒体膜电位和细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)改变,分析灯盏花素对线粒体膜电位和ROS水平的影响。用1mMN-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)与0、25、50、100μM灯盏花素共同处理48h,用ROS检测试剂盒检测细胞内ROS含量改变、MTT细胞增殖实验检测细胞增殖,分析ROS在灯盏花素诱导细胞增殖抑制的影响;用100μM灯盏花素和5μM环孢菌素A(CsA)共同处理A549细胞48h,用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位改变,分析CsA对灯盏花素诱导线粒体膜电位下降的作用;将细胞分为对照组、100 μM灯盏花素组、5 μ CsA+灯盏花素组和1mMNAC+100 μM灯盏花素组,用ROS检测试剂盒检测细胞内ROS含量,分析NAC和CsA在灯盏花素诱导ROS水平增加的作用;4、用A549细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,每日腹腔注射10mg/kg和20mg/kg灯盏花素,每周观察肿瘤的大小、裸鼠体重,第21天时处死小鼠,获取新鲜肿瘤组织,Western blot检测Bax和Bcl-2的表达,分析Bax/Bcl-2比值变化;制作石蜡切片,免疫组织化学检测组织内Ki67和caspase-3表达变化,TUNEL染色检测肿瘤组织内细胞凋亡情况,分析灯盏花素体内抗肺癌作用;5、用0、25、50、100μM灯盏花素处理A549细胞48h,qRT-PCR检测miRNA-7表达改变,分析灯盏花素对A549细胞miRNA-7表达的影响;6、miRNA-7-vector(过表达)和miRNA-7-inhibitor(低表达)转染A549细胞,经100 μM灯盏花素处理48 h,MTT细胞增殖实验检测细胞存活情况,分析miRNA-7对肺癌细胞增殖的作用;Western blot检测Bax、Bcl-2的表达,计算Bax/Bcl-2比值变化,分析miRNA-7在灯盏花素诱导A549细胞凋亡的作用。构建突变型和野生型BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因,经miRNA-7-inhibitor转染,观察荧光素酶活性,分析miRNA-7对Bcl-2的调控作用。7、用0、25、50、100 μM灯盏花素处理A549细胞48 h,用ELISA、Western blot和qRT-PCR检测细胞培养基和细胞内IGFBP-4表达情况,分析灯盏花素对IGFBP-4表达的影响;将细胞分为对照组、过氧化氢组(阳性对照组)、100 μM灯盏花素组、100 μM灯盏花素+1mMNAC组,ELISA、Western blot和RT-qPCR检测IGFBP-4含量改变,分析ROS对灯盏花素诱导IGFBP-4表达的影响;8、IGFBP-4-vector(过表达)和IGFBP-4-siRNA(低表达)转染A549细胞,经100 μ灯盏花素处理48 h,MTT细胞增殖实验检测细胞存活情况,分析IGFBP-4对肺癌细胞增殖的影响;Westernblot检测Bax、Bcl-2表达改变;分析IGFBP-4在灯盏花素增加A549细胞Bax/Bcl-2比值的作用。结果:1、灯盏花素抑制NSCLC细胞增殖,对正常肺纤维细胞无增殖抑制作用:MTT细胞增殖实验显示不同浓度的灯盏花素处理24、48、96h,A549和NCL-H460细胞增殖显著被抑制。A549和NCL-H460细胞在24、48、96 h时的半抑制浓度(IC50)分别为 586.53±36.3、174.36±10.41、70.22±5.12 μM和211.45±21.47、94.17±8.67、46.28±3.89 μM;灯盏花素浓度小于100 μM时,A549和NCL-H460细胞存活率显著降低,而正常肺纤维细胞MRC-5存活率无明显下降。Trypan blue细胞死亡实验结果显示25、50、100 μM灯盏花素增加A549细胞死亡比例。2、灯盏花素诱导细胞凋亡和周期阻滞:Annexin V/PI双染细胞凋亡检测结果显示25、50、100 μM灯盏花素显著增加细胞凋亡率,且以早期细胞凋亡为主;酶标仪检测结果显示25、50、100μM灯盏花素处理A549细胞48h后,Caspase-3活性较对照组显著增加;Western blot结果显示灯盏花素能够显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,增加促凋亡蛋白Bax表达,导致Bax/Bcl-2比值显著增加。细胞周期检测结果显示25、50、100μM灯盏花素诱导细胞周期阻滞在G2/M期。3、灯盏花素增加A549细胞内ROS含量、降低线粒体膜电位:0、25、50、100μM灯盏花素处理A549细胞48h,流式细胞仪检测结果显示DCFH-DA阳性细胞(细胞内ROS含量)显著增高,且同一灯盏花素浓度下,1mMNAC能够降低DCFH-DA阳性细胞数量;酶标仪检测结果显示JC1绿色荧光阳性细胞数量明显增加(线粒体膜电位下降);5μMCsA和100μM灯盏花素共同处理后,JC1绿色荧光阳性细胞数量较100μM灯盏花素处理明显下降。与对照组相比,灯盏花素组ROS含量显著提高,NAC+灯盏花素组和CsA+灯盏花素组ROS含量无明显增加,说明NAC和CsA能够显著抑制100 μM灯盏花素诱导ROS含量增加。4、灯盏花素体内抑制A549细胞移植瘤生长:成功构建A549皮下移植瘤模型,每日10mg/kg和20mg/kg灯盏花素腹腔注射。在第14和21天时,肿瘤大小较对照组明显减小,差异具有统计学意义;而裸鼠的体重无明显降低。第21天处死裸鼠,Western blot检测结果显示10mg/kg和20mg/kg灯盏花素能够显著增加Bax/Bcl-2的比例,免疫组织化学显示细胞增殖标记分子Ki67表达明显降低,而caspase-3的表达明显增加。TUNEL染色结果显示10mg/kg和20mg/kg处理后,细胞凋亡比例较对照组明显增加。5、灯盏花素增加A549细胞miRNA-7表达:qRT-PCR检测结果显示25、50、100μM灯盏花素显著增加A549细胞miRNA-7的表达,说明灯盏花素促进A549细胞miRNA-7 表达。6、miRNA-7介导灯盏花素对A549细胞增殖抑制作用:MTT细胞增殖实验结果显示miRNA-7-minic显著增加灯盏花素对A549细胞增殖抑制作用;而miRNA-7-inhibitor显著降低灯盏花素对A549细胞增殖抑制作用。Western blot检测结果显示miRNA-7-minic转染细胞Bax表达增加,Bcl-2表达降低,Bax/Bcl-2比值增高。经100μM灯盏花素处理48h,与miRNA-NC转染细胞相比,miRNA-7-minic转染细胞中Bax表达增加,Bcl-2表达降低,Bax/Bcl-2比值增高;miRNA-7-inhibitor转染细胞Bax表达降低,Bcl-2表达增加,Bax/Bcl-2比值降低;经100 μM灯盏花素处理48h,与Control-siRNA转染细胞相比,miRNA-7-inhibitor转染细胞Bax表达降低,Bcl-2表达增加,Bax/Bcl-2比值降低;荧光素酶报告基因检测结果显示miRNA-7-inhibitor增加野生型3 ’-UTR Bcl-2荧光素酶活性,而不能增加突变型3’-UTR Bcl-2 荧光素酶活性,说明miRNA-7-inhibitor阻断了miRNA-7降低Bcl-2转录活性,而证实miRNA-7通过结合3 ’-UTR抑制Bcl-2的表达。7、用25、50、100 μM灯盏花素处理A549细胞48 h,ELISA检测结果显示灯盏花素明显增加培养基中IGFBP-4含量;Western blot和RT-qPCR检测结果提示灯盏花素能够增加A549细胞内IGFBP-4蛋白和mRNA的表达。经100μM灯盏花素和1 mMNAC共同处理48 h,ELISA、Western blot和RT-qPCR检测结果显示培养基中IGFBP-4、细胞内IGFBP-4蛋白和mRNA表达均明显下降,提示清除细胞内ROS后,灯盏花素诱导IGFBP-4的表达能力显著下降。8、IGFBP-4介导灯盏花素对A549细胞增殖抑制作用:MTT细胞增殖实验结果显示IGFBP-4-vector显著增加灯盏花素诱导A549细胞增殖抑制作用;IGFBP-4-siRNA显著降低灯盏花素诱导A549细胞增殖抑制作用。Western blot检测结果显示IGFBP-4-vector转染细胞Bax表达增加,Bcl-2表达降低;经100μMM灯盏花素处理48h,与NC-vector相比,IGFBP-4-vector转染细胞中Bax表达增加,Bcl-2表达降低;IGFBP-4-siRNA转染细胞Bax表达降低,Bcl-2表达增加;经100μM灯盏花素处理48h,与NC-siRNA相比,IGFBP-4-siRNA转染细胞Bax表达降低,Bcl-2表达增加。结论:(1)灯盏花素对NSCLC细胞具有选择性杀伤作用,能够诱导细胞凋亡、周期阻滞。(2)灯盏花素能够通过诱导线粒体损伤,降低线粒体膜电位,增加细胞内ROS水平,进而上调miRNA-7和IGFBP-4的表达。(3)miRNA-7结合Bcl-2的3端非编码区(3’-UTR)降低Bcl-2的表达,增加Bax表达,导致Bax/Bcl-2比值增加,引起细胞凋亡。(4)灯盏花素能够通过ROS促进IGFBP-4表达,增加Bax/Bcl-2比值,诱导NSCLC细胞增殖抑制。总之,灯盏花素能够诱导miRNA-7和IGFBP-4的表达增加,抑制NSCLC细胞的增殖,发挥抗肺癌作用。