蝙蝠是世界上仅次于啮齿类的第二大类哺乳动物，其分布于除两极以外的地方，同时也是许多病毒的自然宿主。我国云南省地处西南边陲，与缅甸、老挝、越南等东南亚国家接壤，战略意义突出。该地区是多种疾病的疫源地，研究发现该地区蝙蝠携带有多种人兽共患病毒，如尼帕病毒(Nipah virus)、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、狂犬病毒(Rabiesvirus)、圆环病毒(Circovirus)等。为了有效地监控云南省及周边地区新发传染病(emerging infectious diseases, EID)，防止野生动物(特别是蝙蝠)疫病，跨种和跨境传播给其它动物甚至是人类，保障边境地区人民生命安全，彻底调查该地区蝙蝠病毒生态学具有重要的意义。而基于第二代高通量测序(High-throughputsequencing)的病毒宏基因组学(Viral metagenomics, ViralMeta)则为调查已知和未知病毒提供了高效的工具。本研究于2008年到2011年间，共收集到1,219份外表健康蝙蝠样品，收集地点涵盖邻近云南省的缅甸的昔懂坝县和吴涛县以及我国云南省的6个市县。蝙蝠涉及3个科：蝙蝠科（Vespertilionidae）、菊头蝠科（Rhinolophidae）和假吸血蝠科（Megadermatidae）共5个属11种。经过ViralMeta处理一共得到326,318,951个碱基(nt)，总共5,864,636个读长（reads），经过拼接得到3,605,620个重叠序列（contigs），其中2%的序列注释到了病毒（Virus-like contigs，59,661/3,605,620）。这些病毒中可以进一步分为27个科（包含细小病毒科中的细小病毒亚科和浓核病毒亚科），49个病毒属，包含16个哺乳动物病毒科22个属、5个昆虫病毒科8个属、3个植物病毒科4个属、3个噬菌体科15个属。在哺乳动物病毒中，有腺病毒科中的哺乳动物腺病毒属，疱疹病毒科中的细胞巨化病毒属、马立克病病毒属、玫瑰疹病毒属，异样疱疹病毒科中的鱼疱疹病毒属，乳头瘤病毒科中的甲型乳头瘤病毒属，多头瘤病毒科中的多头瘤病毒属，小双节RNA病毒科中的小双节RNA病毒属，嗜肝病毒科中的正嗜肝病毒属，圆环病毒科中的圆环病毒属，痘病毒科中的正痘病毒属，逆转录病毒科中的γ逆转录病毒属、Δ逆转录病毒属，细小病毒亚科中的依赖病毒属、博卡病毒属，星状病毒科中的哺乳动物星状病毒属，呼肠孤病毒科中的A型轮状病毒，冠状病毒科中的α冠状病毒属、β冠状病毒属，小RNA病毒科中的嵴病毒属、肠道病毒属，黄病毒科中的丙肝病毒属。通过比较发现，蝙蝠种群和地域之间病毒组具有显著的差异，主要体现在病毒的种类、病毒序列与已知序列的同源性差异、病毒序列的丰度等方面。通过该方法充分反应了该地区蝙蝠携带病毒组的情况。根据病毒宏基因组学结果，针对有意义的新发现的腺病毒、正嗜肝病毒、星状病毒、冠状病毒、轮状病毒、软腐病毒等，建立了特异性PCR/RT-PCR检测方法，获得了这些病毒在蝙蝠体内的带毒率情况，结果发现缅甸吴涛县1%（1/84）的大蹄蝠（Hipposideros armiger）携带腺病毒，缅甸昔懂坝县2%(7/320)和吴涛县5%(15/320)的亚洲长翼蝠(Miniopterus fuliginosus)以及我国云南省普洱市20%(4/20)果树蹄蝠(Hipposideros pomona)携带正嗜肝病毒，缅甸吴涛县2%(2/84)的马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)携带星状病毒，祥云11%(13/120)、宾川7%(7/100)、景洪的6%(2/34)的鼠耳蝠为α冠状病毒（Coronavirus, CoV）阳性，而来自保山的14%(2/14)的中菊头蝠(Rhinolophus affinis)为β冠状病毒阳性，德宏6%（1/16）的小菊头蝠(Rhinolophus hipposideros)携带轮状病毒，而软腐病毒则广泛分布在蝙蝠体内。对扩增的部分片段进行遗传分析，发现这些病毒同已知病毒的核苷酸同源性不足85%，提示这些病毒为新型的蝙蝠病毒。针对以上检测结果，挑选了肝炎病毒、冠状病毒和轮状病毒进行深入的分析。获得了3株缅甸和3株云南蝙蝠肝炎病毒的全基因组序列，分析发现缅甸和云南省的蝙蝠肝炎病毒基因组呈现典型的环状结构，且具有明确的进化差异，两者间核苷酸同源性仅为70%，同已知的正嗜肝病毒均具有显著的差异性，核苷酸同源性不足60%，说明发现了两株新型的肝炎病毒；抗原性分析推测该病毒可能与人的乙肝病毒发生交叉反应；直接从样品中电镜观察到了大量的澳大利亚抗原，进一步证实蝙蝠携带肝炎病毒；这是全球首次发现蝙蝠肝炎病毒，极大地丰富了肝炎病毒的多样性。从我国宾川、祥云、景洪等地发现了大量的α冠状病毒（Coronavirus, CoV），基因分析这些αCoV可以形成5个进化分支，且都是新型的αCoV；从我国德宏州的中菊头蝠（Rhinolophus affinis）体内发现了新型的βCoV，全基因组鉴定发现该病毒为更接近人的SARS冠状病毒，而关键的受体结合域(Receptor binding domain, RBD)氨基酸序列同人的SARS冠状病毒具有高度的一致性，瞬时表达S1结构域和Western Blot分析发现该病毒能结合SARS病人的血清，从而从抗原性上证实该病毒与SARS病毒相关；基因重组分析发现该病毒部分基因重组于同在云南省发现的蝙蝠SARS样冠状病毒Rs3367和Yunnan2011毒株，而人的SARS CoV可能是该病毒同蝙蝠SARS样冠状病毒Rp3株和Rf1株的重组体；从而给出更加确切的证据证明蝙蝠就是SARS CoV的自然宿主。从我国云南省芒市的小蹄蝠体内分离到一株新型的蝙蝠轮状病毒(GroupARotavirus, RVA)，获得了该病毒的全基因组学序列，进化分析发现，该病毒为新型的重组毒株，重组来源于不同的猫/犬源轮状病毒(feline/caninerotavirus)，其中VP4和VP7等重要片段重组来自泰国的人流行株(CHM222)和印度的动物源轮状病毒；通过乳鼠接种动物实验，发现该病毒接种剂量为500TCID50时对乳鼠具有100%的致死率，说明该病毒具有潜在的公共卫生威胁。本研究应用病毒宏基因组学方法对云南省及缅甸蝙蝠的病毒组调查。研究结果不仅丰富了该地区蝙蝠病毒数据库，增强了我们对蝙蝠病毒多样性的了解，而且系统获得了这些地区蝙蝠携带病毒组的情况，发现了大量的新型病毒，为评估该地区蝙蝠病毒在公共卫生中的威胁提供了基础数据，同时也反映出不同地域和种类的蝙蝠携带的病毒组具有明显的差异。然而，本研究所发现的蝙蝠病毒仅仅为蝙蝠病毒组学中的“冰山一角”，在未来需要对更多地方和更多种类的蝙蝠进行病毒组学研究，才能真正了解蝙蝠病毒的多样性。本研究同时也提供了一种新的病毒生态学调查方法：病毒宏基因组学与特异性PCR验证结合法。该方法首先用病毒宏基因组学调查样本中病毒组，根据病毒组结果筛选感兴趣的病毒，设计特异的PCR检测方法筛查样品，获得样品该病毒的携带率，同时也可以对该病毒进行针对性的研究，该方法做到了有的放矢，大大降低病毒生态学调查的盲目性，在未来新发传染病的预测预警、新发或再发传染病诊断、环境微生物调查等方面具有极大的应用价值。