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阿尔茨海默病又称老年痴呆症,是一种表现为记忆力减退以及其他认知功能障碍的神经系统退行性疾病。目前治疗该疾病最有效的手段是乙酰胆碱酯酶抑制剂。美国食品药品管理局批准了5种治疗老年痴呆的药物,其中4种为乙酰胆碱酯酶抑制剂,但这些药物存在着肝毒副作用大、患者服用剂量高、日服药次数多、半衰期短、对消化道刺激、成本过高等缺点,因此,开发高效无毒副作用的AChE抑制剂药物是科研工作者的目标。从微生物和药用植物中开发新型的AChE抑制剂（AChEI）已经成为科研工作者研究的热点课题。本实验室前期从蛇足石杉中分离筛选获得一批具有AChE抑制活性的内生真菌菌株,其中菌株LF5发酵提取物具有显著的抑制AChE活性。本文开展了LF5菌株中AChEI追踪分离,利用Ellman分光光度法体外考察了分离获得的化合物对电鳗AChE的抑制活性,随后利用同源建模的方法,以PDB:1F8U蛋白晶体结构为模板,构建体外实验所用的电鳗乙酰胆碱酯酶的三维结构,并以构建的三维结构为受体,利用分子对接的方法研究了小分子配体与电鳗AChE的相互作用机制。为开发新型AChE抑制剂以及抑制剂分子进一步的结构改造,获得高活性化合物提供一定的理论依据。具体内容如下:1.内生真菌LF5中AChEI活性追踪分离及AChE抑制活性的测定。通过对LF5的菌体及发酵液的醇提物进行AChE抑制活性的追踪,发现其菌体醇提物具有很高的AChE抑制活性,随后利用梯度萃取、柱层析等分离技术对该活性部位进行追踪分离,获得活性化合物曲地酸、曲地酸甲酯、曲地酸乙酯。利用Ellman分光光度法体外考察了曲地酸、曲地酸甲酯、曲地酸乙酯等3种小分子化合物对电鳗AChE的抑制活性,其半数抑制率(IC50)分别为66.68μM、23.34μM、20.10μM。这表明,曲地酸、曲地酸甲酯、曲地酸乙酯对AChE均有一定的抑制活性,而且曲地酸结构中C8位酯键的改变对化合物体外活性有一定的影响。2.电鳗AChE同源建模。为了考察这3种小分子与电鳗AChE的作用机制,我们对体外所用的电鳗AChE进行了三维结构的预测。以PDB ID:1F8U蛋白晶体结构为模板,运用同源建模的方法构建了电鳗AChE的三维结构模型,模型经过分子动力学优化后,利用PROCHECK、Verify3D和ProSA工具进行合理性评估。PROCHECK评估结果以拉氏构象图显示,模型的合理性达到99%,Verify3D的评估结果表明所有的氨基酸残基得分均大于0,有80%以上的氨基酸残基得分大于0.2,说明氨基酸所处的位置都很合理。ProSA评估结果,模型的Z-core值大小为-10.7,在合理的范围之内。建模得到的电鳗AChE三维结构包括12个主要的α螺旋、10个主要的β折叠以及连接的Loop区。所获得的电鳗AChE蛋白质三维结构模型用于后续分子对接的研究。3.AChE与曲地酸及其衍生物的分子对接研究。以所构建的电鳗AChE三维空间结构为受体,利用AutoDock 4.0分子对接软件对电鳗AChE与曲地酸及其衍生物进行分子对接研究,来考察小分子与蛋白相互作用的结合能、结合部位以及主要的作用力类型。结果表明,3个小分子均能与电鳗AChE的外周位点和催化活性中心结合,主要作用力类型为氢键、疏水作用以及π-π堆积作用等。曲地酸二苯醚结构中的一个苯环与外周位点的主要氨基酸残基以氢键和π-π堆积相互作用结合,另一个苯环以及苯环上的取代基与催化活性中心主要以疏水作用和氢键相互作用结合。同时,对接结果显示,曲地酸C8位酯键结构的改变影响了其与外周位点的结合力类型以及结合力数目,表现出来的曲地酸、曲地酸甲酯、曲地酸乙酯与电鳗AChE的结合能分别为-7.89kcal/mol、-9.72 kcal/mol、-9.74 kcal/mol,与体外活性实验结果一致,表明对接结合能在一定程度上反映了化合物与AChE结合能力的强弱,也体现了抑制乙酰胆碱酯酶的IC50值。