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当前,中国水产养殖业规模已经达到世界水产养殖业的70%,且比重呈现逐年递增的趋势。与此同时,病原菌的传播与侵染给水产养殖业造成的损失也越来越严重。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilia）作为一种常见的条件致病菌能够使鱼类患败血症,引发出血性败血症、眼眶蜂窝织炎和眼球破裂等症状,最终导致鱼类死亡。此外,它还是人-畜-鱼共患致病菌,严重时甚至可能危害到人类的生命健康。疫苗免疫被认为是抑制嗜水气单胞菌感染最有效的途径之一,但是疫苗存在佐剂、运送、免疫方式等问题,使其规模化生产与使用受到限制。因此,当前迫切需要筛选有效的免疫保护性候选蛋白以及一种良好的疫苗递送佐剂以控制该疾病的传播。课题组前期研究发现,在缺铁环境下高表达的嗜水气单胞菌外膜蛋白能够显著增强斑马鱼的免疫能力,提示铁离子相关外膜蛋白可能作为细菌的疫苗候选蛋白,但是这些候选蛋白的免疫效果可能因为佐剂以及免疫宿主方式等问题受到限制。因此寻找一种更持续、稳定和高效的佐剂是当前此类渔用疫苗开发研究的热点问题。近年来,纳米材料中的单壁碳纳米管（Single-walled carbon nanotube,SWCNTs）通过功能化修饰后可以与蛋白共价结合,而且具有的细胞穿透性好、低毒或无毒等优点,在生物医学领域得到较好的发展,并在水产养殖疫苗中得到初步的应用。通过佐剂的添加提高药物在受体内的药效与作用时间,同时利用纳米材料的穿透细胞膜效应,制备针对水产生物的高效简便疫苗是当前疫苗开发的新思路。为了筛选嗜水气单胞菌高效疫苗亚单位候选蛋白并研究碳纳米管结合免疫候选蛋白对斑马鱼的免疫保护效果,本论文根据课题组前期的研究结果,挑选了7个嗜水气单胞菌外膜蛋白（6个铁离子相关差异蛋白P55870、A0KGK5、A0KIY3、A0KPP0、A0KLQ6、A0KH89以及1个文献报道已明确免疫效果的外膜蛋白A0KHR9（OmpAII）为对照）,通过原核重组获得高表达和纯化蛋白,借助化学合成技术构建碳纳米管载外膜蛋白系统,结合细菌攻毒以及宿主免疫因子检测等试验,比较外膜蛋白与碳纳米管载外膜蛋白,分别在腹腔注射与浸泡免疫模式对斑马鱼的免疫保护效果。具体研究成果如下:首先,以嗜水气单胞菌ATCC 7966基因组为模板,分别将扩增的AHA1279（蛋白名A0KHR9）、AHA1512（P55870）、AHA0854（A0KGK5）、AHA1698（A0KIY3）、AHA3793（A0KPP0）、AHA2699（A0KLQ6）、AHA1098（A0KH89）等七个外膜蛋白PCR产物与原核表达载体重组获得高表达重组菌。所得菌株经超声破碎收集蛋白后,利用镍柱亲和层析获得纯化蛋白,并免疫家兔获得特异性免疫血清。同时利用Western blotting证实嗜水气单胞菌ATCC 7966及强毒株LP-2在加与不加铁离子螯合剂（DIP）处理下的靶蛋白差异表达情况与前期质谱分析情况一致。进一步利用Western blotting实验,以嗜水气单胞菌活菌与灭活菌免疫实验小鼠所得血清为一抗,验证目的蛋白免疫原性。以上结果提示这些外膜蛋白在铁离子动态平衡中起重要的作用,并且可能成为候选疫苗蛋白。其次,利用化学合成技术将候选蛋白与功能化单壁碳纳米管经缩合酰化反应制备单壁碳纳米管载亚单位蛋白系统。选取其中4个蛋白与其碳纳米管负载后的样品,通过傅立叶变换红外光谱仪和扫描电子显微镜观察蛋白与单壁碳纳米管之间的结合效果,结果显示纯化蛋白均紧密、均匀地连接于碳纳米管表面,所制备的碳纳米管载蛋白样品成功,可用于下一步实验。然后,通过腹腔注射与浸泡免疫方式,分别对7个铁离子相关蛋白以及碳纳米管载蛋白进行免疫保护评价,并以BSA+佐剂、单壁碳纳米管为对照,采用qPCR技术对斑马鱼免疫相关基因（Lyz,MHCI,MHCII,IL-1β,IL-8,IL-10和IL-15）的转录水平进行检测。最后,对于腹腔注射组,将蛋白和碳纳米管载蛋白疫苗分别以4个剂量（1、2、3和5μg）下对斑马鱼进行免疫。结果发现,与普通蛋白组对比,碳纳米管载蛋白后能够显著提高免疫相关基因表达量。进一步用嗜水气单胞菌同源强毒株LP-2进行攻毒实验,结果显示在5μg剂量下免疫A0KHR9、P55870、A0KGK5、A0KIY3、A0KPP0、A0KLQ6、A0KH89蛋白分别获得61.6%、42.86%、47.37%、57.67%、94.15%、65.39%、84.96%相对免疫保护率（Relative immune protection rate,RPS）,在5μg剂量下免疫碳纳米管载各蛋白SWCNTs-A0KHR9、SWCNTs-P55870、SWCNTs-A0KGK5、SWCNTs-A0KIY3、SWCNTs-A0KPP0、SWCNTs-A0KLQ6、SWCNTs-A0KH89分别获得68.10%、50.00%、55.56%、66.67%、94.44%、77.50%、90.43%的相对免疫保护率。对于浸泡组,蛋白和碳纳米管载蛋白疫苗分别在4个剂量（10、20、30和40 mg/L）下对斑马鱼进行免疫实验。结果发现与浸泡普通蛋白组对比,碳纳米管载蛋白后能够显著提高免疫相关基因表达量;并用嗜水气单胞菌同源强毒株LP-2进行攻毒实验,结果显示在40mg/L剂量下免疫A0KHR9、P55870、A0KGK5、A0KIY3、A0KPP0、A0KLQ6、A0KH89蛋白分别获得30.80%、20.00%、22.22%、22.22%、29.29%、25.85%、37.80%相对免疫保护率,在40 mg/L最高剂量下免疫碳纳米管载蛋白疫苗SWCNTs-A0KHR9、SWCNTs-P55870、SWCNTs-A0KGK5、SWCNTs-A0KIY3、SWCNTs-A0KPP0、SWCNTs-A0KLQ6、SWCNTs-A0KH89分别获得63.60%、52.94%、55.56%、61.11%、86.11%、73.74%、68.49%相对免疫保护率。以上结果表明,A0KPP0、A0KLQ6和A0KH89蛋白与其相对应碳纳米管结合蛋白,在注射免疫模式下的相对免疫保护率都在60%以上,高于外膜蛋白OmpA,是潜在的候选亚单位疫苗。在浸泡免疫中,单独浸泡蛋白免疫保护作用并不明显,最高为37.80%;而碳纳米管载蛋白后,所有实验组的免疫保护效果都得到明显的提升,其中SWCNTs-A0KPP0、SWCNTs-A0KLQ6和SWCNTs-A0KH89三个组效果更好,达到68%以上。以上研究结果提示,嗜水气单胞菌铁离子限制下差异外膜蛋白制备成亚单位疫苗,能够在斑马鱼体内具有较好的免疫应答反应和相对免疫保护作用。在碳纳米管为载体后的疫苗腹腔注射免疫斑马鱼,能够显著提高其亚单位疫苗的体内免疫应答反应和相对免疫保护率。特别是在浸泡免疫模式下,碳纳米管能够显著提升亚单位疫苗在浸泡给药途径中的药效,有效缓解亚单位疫苗因降解在浸泡免疫中效价降低的问题。综上所述,铁离子限制下嗜水气单胞菌外膜蛋白A0KPP0、A0KLQ6和A0KH89等蛋白能够作为抗嗜水气单胞菌的亚单位疫苗候选蛋白,而单壁碳纳米管载蛋白通过注射免疫与浸泡免疫均能显著提升免疫疗效,是一种结合疫苗的适宜纳米载体。以上研究为寻找高效的嗜水气单胞菌亚单位疫苗候选蛋白以及佐剂提供理论依据。