不良妊娠所致的胚胎或胎儿生长发育受限被称为宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation,IUGR）,它是一种常见的出生缺陷病,表现形式经常为低出生体重。IUGR的诱因除先天遗传因素外,主要诱因为孕期不良宫内环境（包括母体和外源环境因素）。国内、外学者对孕期不良环境、出生体重与成年慢性疾病之间的关系进行了大量研究,提出—“健康与疾病发育起源（Developmental Origins of Health and Disease,DOHa D）”。下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）轴编程改变是IUGR子代成年后疾病易感的核心机制。肾上腺作为HPA轴的终末效应器官,其发育最早、最快,负责了多种甾体激素的合成。研究提示孕期不良环境暴露所致的IUGR子代成年后代谢综合征的风险增加,其原因是不良环境暴露所致的肾上腺发育异常介导的糖皮质激素（glucocorticoid,GC）分泌异常。因此,宫内时期肾上腺功能发育状况是决定子代器官发育及其出生后命运的关键因素。本室前期研究表明,孕期咖啡因暴露（prenatal caffeine exposure,PCE）可导致IUGR胎鼠母源性GC过暴露,引起子代HPA轴发育抑制,出生后HPA轴呈现低基础活性和应激高敏感性,且血糖、脂代谢表型呈现GC依赖性变化;同时胎肾上腺甾体激素合成酶系统表达抑制。基于此,我们提出:PCE所致的母源性GC过暴露介导的胎肾上腺功能抑制可能是PCE下子代代谢综合征及相关疾病易感的核心机制。2型11b-羟类固醇脱氢酶（11b-hydroxysteroid dehydrogenase 2,11b-HSD2）为GC代谢酶,负责将活性GC（在人为皮质醇、在啮齿动物为皮质酮）转化为无活性GC（可的松、11-脱氢皮质酮）,从而构成了多组织的GC“屏障”。11b-HSD2在肾上腺有表达,提示肾上腺局部可能存在GC“屏障”。本研究初步证实PCE致胎鼠肾上腺11b-HSD2表达异常介导PCE子代出生后肾上腺功能易感性改变,进一步确证肾上腺11b-HSD2表达或皮质酮水平与肾上腺最大截面积和最大直径的关系,并结合人胎肾上腺细胞系H295R来探究PCE所致肾上腺11b-HSD2表达抑制的具体分子机制,同时在细胞水平探索咖啡因和皮质醇联合作用对11b-HSD2表达的影响。本研究对了解PCE所致肾上腺发育毒性,认识PCE所致胎源性疾病的宫内起源现象,进一步剖析其潜在的发生机理,具有重要的理论价值。第一部分 孕期咖啡因暴露所致子代大鼠出生前、后血清代谢谱及其特征性变化目的:流行病学调查证实孕期咖啡因摄入可引起子代IUGR、出生后认知功能障碍和肥胖风险增加。我们既往的研究证实,PCE可导致子代大鼠IUGR,并伴有多器官发育毒性及出生后多疾病易感,并提出宫内母源性糖皮质激素过暴露介导了IUGR子代多疾病易感的宫内神经内分泌代谢编程机制。本研究在本室成熟建立的PCE所致大鼠IUGR模型上,基于液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）联用代谢组学技术,分析了雌、雄性子代大鼠出生前、后血代谢谱变化,并探讨了IUGR个体的近期和远期毒性、代谢变化特征及性别差异。方法:受孕Wistar大鼠于孕9-20天（gestation day 9-20,GD9-20）灌胃给予咖啡因（120 mg/kg·d）,在GD20麻醉处死部分动物并取血;另一部分动物饲养至出生后,记录两周体重变化,于出生后12周（postal week,PW12）麻醉取血,检测肝肾功能指标,同时基于LC-MS联用代谢组学技术对比分析了雌、雄胎鼠和成年鼠血清代谢谱的变化。结果:PCE雌、雄性子代大鼠均出现低出生体重、出生后追赶性生长及成年肝肾功能出现异常。进一步发现,与各自对照组相比,PCE雌、雄性胎鼠血代谢谱差异代谢物主要表现在:氨基酸和脂质代谢紊乱,多种代谢通路异常,并存在一定的性别差异。而成年后,PCE雌、雄性子代差异代谢物数量较宫内时期明显减少,尤以雌性变化明显,差异代谢物类型也与宫内不尽一致,并存在更为明显的性别差异。其中,差异代谢物（如磷脂、血小板活化因子、花生四烯酸、胆汁酸、鞘氨醇-1-磷酸、硫酸吲哚酚及11-脱氧皮质酮）可能参与了PCE子代多器官（如海马、肝脏、肾脏和肾上腺）发育毒性及成年相关疾病易感的主要病理生理过程。结论:PCE会导致大鼠子代糖、氨基酸与脂质等三大类物质代谢紊乱,与多脏器发育毒性和出生后成年多疾病易感密切相关。本研究全面而系统的展现了咖啡因近、远期发育毒性及性别差异,为探寻IUGR子代成年多疾病易感的早期预警和药物干预治疗靶标,提供了新思路。第二部分 孕期咖啡因暴露所致子代大鼠肾上腺功能易感性改变的宫内编程机制目的:采用整体动物实验,观察PCE致肾上腺形态结构和功能、血皮质酮、肾上腺皮质酮水平以及肾上腺11b-HSD2表达变化,进一步探究肾上腺11b-HSD2表达与皮质酮水平、肾上腺发育的关系,以及11b-HSD2表达变化在PCE所致子代大鼠肾上腺功能易感改变的可能作用及机制。方法:Wistar孕鼠分为对照组和PCE组,于GD9-20分别给予生理盐水或咖啡因（30,120 mg/kg.d）灌胃。部分孕鼠于GD20用异氟烷麻醉处死,取雌、雄性胎鼠,其余孕鼠自然分娩并饲养至PW6或PW28处死,获取血清和肾上腺组织。酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immune-sorbent assay,ELISA）检测胎鼠、成年鼠血清和肾上腺组织内生皮质酮（corticosterone,CORT）含量;苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察肾上腺组织病理学变化;免疫荧光（immunofluorescence assay）检测肾上腺11β-羟类固醇脱氢酶2（11b-HSD2,11b-hydroxysteroid dehydrogenase）的蛋白水平;染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）检测11b-HSD2基因启动子区组蛋白3赖氨酸9乙酰化（histone 3 Lysine 9 acetylation,H3K9ac）和H3K14ac、H3K27ac的变化。实时定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-q PCR）技术检测肾上腺多个基因的m RNA表达,包括:11b-HSD2、GR、HDAC1-11、孤儿核第4亚族A1受体（orphan nuclear receptor subfamily 4,group A,member 1,NR4A1）、甾体激素急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein,St AR）、细胞色素P450侧链裂解酶（cytochrome P450 cholesterol side chain cleavage,P450scc）、类固醇21-羟化酶（steroid 21-hydroxylase,P450c21）、类固醇11-羟化酶（steroid 11-hydroxylase,P450c11）和3β-羟类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD）。结果:（1）胎肾上腺形态学及甾体激素合成酶系统:与对照组相比较,PCE组雌、雄胎鼠肾上腺细胞最大截面积和最大直径减少（P<0.05,P<0.01）;雌、雄性胎鼠CORT合成酶系统,如NR4A1、St AR、P450scc、3β-HSD、P450c21和P450c11表达显著降低（P<0.05,P<0.01）。（2）胎血CORT水平、胎肾上腺11b-HSD2表达及与胎肾上腺最大直径和最大面积的相关性:与对照组相比较,PCE组雌、雄胎鼠血皮质酮浓度显著增加（P<0.05,P<0.01）,雌、雄胎肾上腺局部11b-HSD2表达显著降低（P<0.05,P<0.01）。雌、雄胎血皮质酮浓度和肾上腺11β-HSD2表达均呈现负相关,胎肾上腺11b-HSD2表达与胎肾上腺最大横截面积及最大直径呈正相关,雌性较雄性更为显著。（3）出生后血CORT水平、肾上腺11b-HSD2表达及与肾上腺最大直径和最大面积的相关性::与对照组相比较,PCE组雌性子代肾上腺最大截面积和最大直径显著减少（P<0.05,P<0.01）;PCE组雄子代肾上腺皮质最大截面积和最大直径无显著改变。在检测成肾上腺甾体激素合成基因时,PW6:PCE组成年雌性子代肾上腺甾体激素合成标志基因如NR4A1、St AR、P450scc和P450c21降低（P<0.05,P<0.01）,而3β-HSD和P450c11无显著改变;雄性P450scc表达降低（P<0.05）,其它基因无显著改变。PW28:PCE组成年雌性子代肾上腺甾体激素合成标志基因,如NR4A1、St AR、P450scc、P450c21和P450c11降低（P<0.05,P<0.01）,而3β-HSD无显著改变;雄性各个甾体激素合成标志基因均无显著改变。（4）宫内和出生后表遗传:与对照组相比,PCE组雌性胎鼠肾上腺局部11β-HSD2启动子区H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac水平较对照组显著降低（P<0.01,P<0.05）,雄性H3K14ac和H3K27ac水平较对照组显著降低（P<0.01,P<0.05）,而H3K9ac无显著改变;在PW6,PCE可致雌性子代11β-HSD2启动子区H3K14ac和H3K27ac水平降低（P<0.01,P<0.05）,而H3K9ac无显著性改变,雄性H3K27ac降低（P<0.01）,而H3K9ac和H3K14ac无显著改变;在PW28,PCE可致雌性子代11β-HSD2启动子区H3K14ac降低（P<0.01）,而H3K9ac和H3K27ac水平无显著性改变,而雄性均无显著性改变。PCE组雌、雄性胎肾上腺局部GR表达较对照组增加,转录因子Sp1表达较对照组降低（P<0.01,P<0.05）。通过生物信息学分析11β-HSD2启动子区时,我们发现11β-HSD2启动子区具有GR结合位点,PCE可致GR与11β-HSD2启动子区结合显著增加（P<0.01）。与对照组相比较,PCE组雌性胎肾上腺局部HDAC4表达较对照组增加（P<0.01）,其它亚型无显著改变。结论:PCE可导致胎鼠肾上腺发育不良,并可能与PCE下肾上腺局部11β-HSD2表达抑制有关。一方面,胎肾上腺GC灭活作用减弱,肾上腺暴露于高浓度GC,导致肾上腺发育和甾体激素合成功能异常;另一方面,这种由11β-HSD2降低导致的肾上腺“GC屏障”作用减弱从宫内延续到出生后,影响PCE子代肾上腺的发育和甾体激素合成功能。而PCE所致11β-HSD2表达抑制可能与GR/HDAC4/11β-HSD2调控轴介导糖皮质激素过度活化所致的11β-HSD2基因启动子区组蛋白修饰异常有关。第三部分 皮质醇所致人胎肾上腺皮质细胞11β-HSD2表达降低及其分子机制目的:在人胎肾上腺H295R细胞系上,探究皮质醇对GR/HDAC4信号及11b-HSD2表达的影响,确证皮质醇影响11b-HSD2表达的机制;同时探究皮质醇对H295细胞功能的影响及11b-HSD2表达的介导作用。方法:培养人胎肾上腺H295R,用不同浓度皮质醇（0、300、600、1200 n M）处理细胞5天。进一步用皮质醇（600 n M）分别联合以GR拮抗剂RU486（10mM）、HDAC4拮抗剂LMK-235（10μM）和pc DNA3.1-11β-HSD2（2.5mg）来处理H295R细胞。采用MTS方法来检测细胞活性,RT-q PCR检测GR、HDAC4、Sp1和11b-HSD2的m RNA水平,免疫荧光技术检测HDAC4和11b-HSD2的共定位,Western blotting检测GR、HDAC4和11b-HSD2的蛋白水平,Ch IP技术检测GR和11b-HSD2基因启动子区的结合以及11b-HSD2基因启动子区H3K14ac的变化,免疫共沉淀（coimmunoprecipitation,Co-IP）技术检测GR与HDAC4蛋白之间相互作用。结果:（1）细胞活性:与对照组相比,用不同浓度皮质醇处理细胞5天后,细胞的活性无显著改变。（2）细胞11b-HSD2的表达:与对照组相比,皮质醇浓度依赖性降低11b-HSD2的m RNA和蛋白表达（P<0.05,P<0.01）。（3）细胞GR/HDAC4/Sp-1变化:与对照组相比,皮质醇浓度依赖性增加GR和HDAC4的m RNA表达（P<0.05,P<0.01）,而对Sp1表达无显著影响;与对照组相比,皮质醇可致HDAC4蛋白水平增加P<0.05,P<0.01),600 n M皮质醇处理后,细胞质中GR蛋白不变而细胞核中GR蛋白增加。免疫荧光结果显示GR和HDAC4存在细胞共定位;进一步Co-IP结果显示,与对照组相比,用600 n M皮质醇处理细胞后,GR和HDAC4之间蛋白-蛋白相互作用增加。（4）GR介导皮质醇所致HDAC4和11b-HSD2表达变化:与对照组相比,600 n M皮质醇上调HDAC4表达、下调11b-HSD2表达（P<0.05,P<0.01）,而GR拮抗剂RU486逆转皮质醇对HDAC4和11b-HSD2表达的效应（P<0.05,P<0.01）;另外,Ch IP实验结果显示,600 n M皮质醇处理可显著增加GR与11b-HSD2基因启动子区的结合,显著降低11b-HSD2基因启动子区H3K14ac水平,而RU486可逆转该现象（P<0.05,P<0.01）。（5）HDAC4参与皮质醇所致11b-HSD2表达改变:与对照组相比,LMK-235干预对GR表达无明显影响,但是增加11b-HSD2表达（P<0.05,P<0.01）,同时取消皮质醇所致11b-HSD2表达降低效应（P<0.05,P<0.01）;另外,Ch IP实验结果显示,600 n M皮质醇处理可显著降低11b-HSD2基因启动子区H3K14ac水平,而LMK-235可逆转该现象（P<0.05,P<0.01）。（6）11b-HSD2介导皮质醇所致H295R细胞甾体激素合成功能改变:与对照组相比,皮质醇可浓度依赖性抑制NR4A1、St AR、P450scc、P450c21和3β-HSD的m RNA表达（P<0.05,P<0.01）,这些抑制作用可被11β-HSD2过表达所逆转（P<0.05,P<0.01）,而皮质醇对P450c11的m RNA表达无显著影响。结论:高浓度皮质醇可抑制人肾上腺H295R细胞甾体激素合成功能,且可能由高浓度皮质醇所致细胞中11β-HSD2表达抑制所介导。11β-HSD2表达抑制的机制可能是:一方面高浓度皮质醇激活GR,GR转位入核后与HDAC4相互作用,引起11β-HSD2启动子区H3K14ac降低,从而使11β-HSD2表达减少;另一方面GR活化与11β-HSD2启动子区结合增加抑制其转录使其表达减少。第四部分 咖啡因所致人胎肾上腺皮质细胞11b-HSD2表达降低及其分子机制目的:在人胎肾上腺H295R细胞系上,探究咖啡因对A2AR/c AMP/PKA/Sp1信号以及11b-HSD2表达的影响,并进一步通过反证实验确定A2AR/c AMP/PKA/Sp1在咖啡因影响11b-HSD2表达中的作用。初步探索咖啡因和皮质醇联合作用对11b-HSD2表达的影响。方法:用不同浓度咖啡因（0、0.1、1、10和100mM）处理人胎肾上腺H295R细胞5天。进一步用咖啡因（10mM）分别联合以A2AR激动剂CGS21680（2mM）和腺苷酸环化酶激动剂Forskolin（20mM）来处理H295R细胞。最后用600 n M皮质醇联合不同浓度咖啡因（0、0.1、1、10、100mM）来处理H295细胞5天。采用MTS法来检测细胞活性,RT-q PCR检测A2AR、Sp1和11b-HSD2的m RNA水平,ELISA检测细胞内c AMP/PKA含量,Western blotting检测11b-HSD2的蛋白水平,Ch IP技术检测11b-HSD2基因启动子区H3K14ac的水平。结果:（1）细胞增殖:与对照组相比,不同浓度咖啡因处理细胞5天后,细胞活性无显著改变。（2）细胞11b-HSD2表达:与对照组相比,咖啡因以浓度依赖性方式降低11b-HSD2的m RNA和蛋白质水平（P<0.05,P<0.01）,但对11b-HSD2启动子区H3K14ac水平无显著影响。（3）细胞A2AR/c AMP/PKA/Sp1信号变化:与对照组相比,咖啡因浓度依赖性降低A2AR/c AMP/PKA/Sp1的信号（P<0.05,P<0.01）。（4）A2AR介导咖啡因所致c AMP/PKA/Sp1信号及11b-HSD2表达变化:与对照组相比,10mM咖啡因可抑制c AMP/PKA/Sp1的信号（P<0.05,P<0.01）,但是这些作用均可被A2AR激动剂CGS21680所减弱（P<0.05）;另外,与对照组相比,用10mM咖啡因处理后,11b-HSD2的m RNA和蛋白表达均减少（P<0.01）,这些作用均可被A2AR激动剂CGS21680所减弱（P<0.05）。（5）c AMP/PKA介导咖啡因所致11b-HSD2表达变化:与对照组相比,10mM咖啡因可抑制c AMP/PKA/Sp1的信号（P<0.05,P<0.01）,但是这些作用均可被腺苷酸环化酶激动剂Forskolin所减弱（P<0.05）;另外,与对照组相比,用10mM咖啡因处理后,11b-HSD2的m RNA和蛋白表达均减少（P<0.01）,这些作用均可被腺苷酸环化酶激动剂Forskolin所减弱（P<0.05）。（6）皮质醇和咖啡因对11β-HSD2表达的联合作用:不同浓度咖啡因与皮质醇联合作用可放大皮质醇对11β-HSD2的抑制作用（P<0.05,P<0.01）。结论:咖啡因抑制人胎肾上腺H295R细胞11β-HSD2表达,其机制可能是咖啡因通过作用于A2AR,抑制c AMP/PKA,从而下调Sp1的表达,后者通过引起11β-HSD2转录激活减弱,导致11β-HSD2表达抑制。同时咖啡因可以放大皮质醇对11β-HSD2的抑制作用。全文总结:本研究我们首先运用代谢组学技术发现PCE子代大鼠肾上腺功能异常。接着我们以11β-HSD2为切入点,探索其在PCE所致子代大鼠肾上腺功能抑制中的作用。发现既有GC的作用,也有咖啡因的作用。一方面,GC可能通过激活GR,使其转位入细胞核,并与HDAC4相互作用,引起肾上腺11β-HSD2的表遗传和表达改变,并且这种改变可持续到出生后,介导肾上腺功能易感性改变;另一方面,咖啡因通过拮抗A2AR,抑制c AMP/PKA/Sp1信号通路介导11β-HSD2的低表达。同时咖啡因可以增强GC对11β-HSD2表达及表遗传的抑制作用。本研究全面而系统的展现了咖啡因的近期及远期发育毒性及性别差异,探寻IUGR子代成年多疾病易感的早期预警和药物干预治疗靶标,提供了新思路。