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卵菌(Oomycete)是一类真核生物,寄主范围较广,能够在植物和动物上引起病害。其中疫霉属(Phytophthora)病原菌有160余种,数量庞大,是一类重要植物病原菌,能够引起作物毁灭性病害。如致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病,在19世纪中叶导致“爱尔兰大饥馑”,目前仍给全球农业生产造成每年约67亿美元的损失;大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根腐病,平均每年给全世界大豆生产造成约10-20亿美元经济损失。由于对其致病机理缺乏了解,这限制了病害防控技术的发展。因此,对其致病机制的研究将有助于我们发掘有用的技术来控制病害的发生。生物信息学分析发现大豆疫霉基因组中编码约400个RXLR类效应分子,研究表明RXLR效应分子具有抑制植物免疫反应的功能,但绝大多数效应分子抑制植物免疫反应的机理还不是很清楚。本实验室前期通过转录组分析发现大量的RXLR效应分子在侵染阶段上调表达,并且能够抑制植物免疫反应。本研究在实验室前期研究基础上进一步阐述其中一个关键效应分子Avh23抑制植物免疫反应的作用机制。Avh23在侵染阶段诱导表达,与植物中的组蛋白乙酰转移酶复合体SAGA的亚基ADA2互作,调控GCN5介导的组蛋白乙酰化修饰,从而抑制植物的免疫反应,促进病原菌的侵染。该研究表明Avh23可以在表观水平上抑制植物免疫反应的新策略。大豆疫霉RXLR效应分子Avh23的功能分析.在大豆疫霉侵染大豆的过程中,Avh23被诱导表达,在侵染后期12-24h表达量达到最大。Avh23在大豆疫霉四个生理小种中没有序列多态性;并且在P.parasitica、P.infestans、P.ramorum、P.capsici、Hyaloperonospora arabidopsidis等卵菌病原菌中没有同源性较高的蛋白。利用SMART数据库对其功能域进行预测分析发现,其C端含有两个内部重复序列IR1(Internal repeat)和 IR2。实验证明 Avh23 能够抑制 BAX、INF1、Avh241、Avh238和XEG1诱导的细胞坏死。利用CRISPR/Cas9技术敲除大豆疫霉中的Avh23基因,并不影响其生长速率,但是突变体的致病能力显著下降,这表明Avh23在大豆疫霉与寄主互作过程中具有重要的毒性功能。Avh23抑制植物免疫反应的分子靶标鉴定.在大豆毛状根毛和烟草叶片中表达Avh23能够促进疫霉菌的侵染,这表明Avh23能够抑制植物的免疫反应。为了进一步阐述Avh23抑制植物免疫反应的作用机制,我们通过酵母筛库的方法鉴定其在大豆体内的靶标蛋白是ADA2。ADA2是组蛋白乙酰转移酶复合体SAGA的一个亚基,通过调控催化亚基GCN5的酶活影响SAGA复合体的功能。我们发现Avh23与大豆和烟草体内的ADA2亚基都是能够互作的。根据Avh23序列特征和逐段突变的方法,我们鉴定到Avh23的C端重复序列(IR1和IR2)内的FVxR(Phe-Val-any-Arg)序列对Avh23与ADA2蛋白互作是必需的,同时也证明Avh23与ADA2互作与Avh23抑制植物免疫反应是相关的。进一步的研究发现Avh23能够与ADA2竞争性结合,阻止其对GCN5亚基的招募,从而破坏ADA2-GCN5亚复合体的形成。Avh23通过上述方式能够减少ADA/GCN5介导的组蛋白H3K9的乙酰化水平,促进疫霉菌的侵染。同时,在烟草上共表达Avh23与ADA2蛋白时,发现Avh23能够改变ADA2的亚细胞定位,将其从细胞核颗粒结构上重新定位到整个核质中。此外,在大豆毛状根毛和烟草叶片中沉默ADA2和GCN5加强了植物对大豆疫霉和辣椒疫霉的感病性,表明ADA2和GCN5正调控植物对疫霉的抗性,同时Avh23突变体T94的毒性在沉默植株上能够部分恢复,这说明了 Avh23的毒性依赖于ADA2和GCN5的功能。因此,Avh23通过ADA2调控GCN5介导的乙酰化,在表观水平上抑制寄主的免疫反应从而促进病原菌的侵染。Avh23调控GCN5介导的植物免疫反应机制研究。ADA2和GCN5在植物响应非生物因素胁迫时具有重要的生物学功能,但其在响应生物因素刺激时的功能还不清楚。本研究证明ADA2和GCN5都是正调控植物对疫霉菌的抗性,但是具体的机制还不清楚。本章研究中,以RNA-seq数据为线索来探究ADA2和GCN5如何调控植物的免疫反应。RNA-seq数据表明:与对照根毛(表达空载体,EV)相比,在表达Avh23(35S-Avh23)的根毛中有484个基因显著上调表达,1712个基因下调表达;在沉默大豆GmGCN5(GmGCN5-RNAi)的根毛中有1206个基因显著上调表达,3202个基因下调表达;这说明了大量的基因在35S-Svh23和GmGCN5-RNAi样品中下调表达。同时,这两个样品中重叠基因的皮尔森相关系数为R2=0.73,表明Avh23调控基因的表达依赖于GCN5的功能。进一步的分析表明共有1528个基因在两个样品中都有差异表达,其中190个上调表达,1338个下调表达,初步分析发现在下调的基因中有141个与植物防卫相关。之后我们通过染色质免疫共沉淀定量PCR(ChIP-qPCR)的方法证明了其中10个防卫基因启动子处的H3K9的乙酰化水平显著下降,这表明Avh23通过减少GCN5介导的H3K9的乙酰化水平进而抑制防卫基因的表达,导致植物感病。