基于固定化酶的硫辛酸甾醇酯的酶法制备与活性研究

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jiangcongzhi
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硫辛酸在抗氧化、血糖值的安定化、保护肝脏、抗衰老、抵抗癌症等方面中都有着不可替代的作用,但硫辛酸具有光热不稳定性,常温下易分解且溶解度不高,生物利用度较低的问题。这大大限制了其在不同行业领域的应用。为了提高硫辛酸的稳定性和溶解性,拓宽其在不同行业领域的应用,本文选用功能活性物质甾醇与硫辛酸通过酯化合成了硫辛酸甾醇酯,并研究了它的理化性质。针对目前硫辛酸甾醇酯酶法合成中存在的反应时间长、催化效率低的问题,在这项工作中,以皮克林乳液体系作为固定化酶的制备工厂,超声波作为固定化的辅助手段,辛基疏水修饰的中空介孔硅球为载体成功制备出高活性的固定化酶(UIP-HMSS@CRL)。利用TEM、SEM、BET、FTIR和TGA对载体材料和固定化酶的结构和部分物理化学性质进行了表征。考察了固定化的影响因素,确定了最佳的固定化条件为:磷酸缓冲液pH值为7,初始酶浓度为14 mg/mL,C8-HMSS的占比为3.0 wt%,Rw/o为7.5:1,超声条件为100 W,10 min。考察了固定化酶的重复使用性、热稳定性和动力学参数。结果表明,即使在65℃,UIP-HMSS@CRL的酯化率也高达78.3%。固定化酶在重复使用10个循环后,仍然能达到90.0%的酯化率。合成硫辛酸谷甾醇酯的动力学结果表明,UIP-HMSS@CRL催化体系的表观动力学常数Vm/Km=11.24í10-3,是普通水相体系固定化酶(C8-HMSS@CRL)和游离CRL催化体系的3.6倍和8.1倍。此外,利用红外光谱定量测定了超声波处理和Pickering乳液体系对脂肪酶二级结构的影响。红外拟合结果显示:超声处理和Pickering乳液体系均会引起酶构象中β-折叠结构的增加和α-螺旋结构的减少。将固定化酶应用到硫辛酸和甾醇的酯化反应中,实现了硫辛酸甾醇酯的高效酶法制备。通过单因素实验,优化了固定化酶催化酯化合成硫辛酸甾醇酯的工艺条件。确定最佳酯化条件为:甾醇占比为120 mmol/L,甾醇与硫辛酸的摩尔比例为1:2,酶的添加量为18 g/L,反应温度50℃。对比了CRL、UI-CRL(超声辅助CRL)、C8-HMSS@CRL以及UIP-HMSS@CRL的催化性能。结果表明,UIP-HMSS@CRL作为酶促酯化反应的催化剂,能够在最短的时间内获得最高的CE值(catalytic efficiency),它的含义是单位时间(h)内单位催化剂(g)转化的底物摩尔数)(6.4mmol g-1 h-1),分别是C8-HMSS@CRL、UI-CRL和游离CRL的1.7倍、4.9倍和9.1倍。用不同的甾醇(谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、胆甾醇)与硫辛酸进行酯化反应,UIP-HMSS@CRL表现出良好的催化性能,催化效率均比游离CRL高8.5-9.8倍。这些结果表明UIP-HMSS@CRL具有广泛的适应性和高效性。通过60℃烘箱加速氧化法、Rancimat法和差示扫描量热法(DSC),考察了甾醇、硫辛酸和硫辛酸甾醇酯对亚麻籽油氧化稳定性的影响。结果表明,硫辛酸、甾醇均可以提高亚麻籽油的抗氧化性能,且产物硫辛酸甾醇酯具有高于两母体分子的抗氧化活性。
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