【摘 要】
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稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究植物与病原菌相互作用的重要模式病原真菌,由其引起的稻瘟病是一种世界性的病害。Mps1位于稻瘟病菌MoMck1-MoMkk1-Mps1 MAPK信号通路的最下游,是稻瘟病菌附着胞侵入和扩展所必需的,通过磷酸化作用来调控稻瘟病菌的致病性。Mps1通过与其上游的激酶激酶MoMKK1和磷酸酶Pmp1的相互作用来调节其磷酸化水平。目前,Mps1及其在其他
【基金项目】
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国家农业部公益性行业（农业）科研专项“保护地果蔬灰霉病绿色防控技术研究与示范”（201303025）；
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稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究植物与病原菌相互作用的重要模式病原真菌,由其引起的稻瘟病是一种世界性的病害。Mps1位于稻瘟病菌MoMck1-MoMkk1-Mps1 MAPK信号通路的最下游,是稻瘟病菌附着胞侵入和扩展所必需的,通过磷酸化作用来调控稻瘟病菌的致病性。Mps1通过与其上游的激酶激酶MoMKK1和磷酸酶Pmp1的相互作用来调节其磷酸化水平。目前,Mps1及其在其他真菌中同源蛋白质的三维空间结构尚未见报道,且与上游激酶激酶和磷酸酶之间相互作用的机制及其调控磷酸化作用的结构基础均不清楚。为此,作者开展了与Mps1相关的结构生物学研究,主要取得了以下结果:1.开展了 Mps1目标蛋白质的重组表达与纯化,制备了纯度较高、稳定性较好、状态较为均一的目标蛋白质样品:采用座滴式气相扩散法对目标蛋白质进行了晶体生长条件的筛选与优化,获得了大小合适、可用于衍射的Mps1蛋白质晶体;通过X-射线衍射收到了高分辨率的蛋白质晶体衍射数据,并以同源蛋白质（ERK2）的结构为模板采用分子置换的方法得到了分辨率为1.99 A的Mps1蛋白质晶体结构。2.通过分析Mps1的蛋白质晶体结构发现Mps1存在一种独特的自身相互作用机制:即A分子的羧基端非激酶功能域与B分子的激酶功能域之间存在相互作用。酵母双杂交和免疫共沉淀实验进一步证实了 Mps1的激酶功能域（Mps1 1-360）与羧基端非激酶功能域（Mps1361-415）之间存在着直接的相互作用。分子筛层析和分析型超速离心分析实验的结果进一步表明:这种相互作用主要发生在Mps1的激酶功能域（Mps1 1-360）与羧基端非激酶功能域（Mps136-415）之间。3.酵母双杂交实验则表明Mps1的羧基端非激酶功能域调控了其与上游激酶激酶MoMkk1和磷酸酶Pmp1之间的相互作用;同时,大肠杆菌表达的Mps1羧基端非激酶功能域（Mps1361-415和Mps140-415）对其自身的磷酸化水平（磷酸化修饰位点为Y188）具有显著的抑制作用。4.利用差式扫描荧光测定技术初步筛选到了 8个与Mps1可能存在相互作用的小分子抑制剂,并开展了 Mps1与上述8个候选小分子抑制剂共晶生长条件的筛选;获得了一些蛋白质晶体,但是最终解析的结构中均没有相应的小分子抑制剂。目前,正在开展上述复合物样品的准备、晶体生长条件的筛选和新的潜在抑制剂的筛选。总之,本研究首次解析了植物病原真菌中促分裂原活化蛋白激酶的蛋白质晶体结构,并揭示了一种新的MAPK自身相互作用模式,为深入阐释真菌Bck1-Mkk1-S1t2 MAPK信号通路中MAPK自身相互作用及调控与其他互作蛋白质之间相互作用的分子机理提供了结构线索。同时,高分辨率Mps1蛋白质晶体结构的获得也为针对该MAPK途径基于结构来设计绿色杀菌剂提供了坚实的结构基础。
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