【摘 要】
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研究背景及目的地中海贫血是中国南方人群携带率较高的一种单基因遗传病,主要包括α-地中海贫血和β-地中海贫血。地中海贫血是由复杂机制引起的,包括拷贝数变异（CNV）和单核苷酸变异（SNV）。目前地贫主要的检测方式以Gap-PCR技术和PCR-RDB技术为主,但是这些检测技术只能检测已知的CNV或SNV,且对于CNV和SNV只能分开检测,操作过程复杂。本研究旨在应用多重PCR测序技术对CNV和SNV的
【基金项目】
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广州市科技计划项目（201704020114）; 广东省自然科学基金项目（2018A030313286）; 广州市健康医疗协同创新重大计划（201803040009）
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研究背景及目的地中海贫血是中国南方人群携带率较高的一种单基因遗传病,主要包括α-地中海贫血和β-地中海贫血。地中海贫血是由复杂机制引起的,包括拷贝数变异（CNV）和单核苷酸变异（SNV）。目前地贫主要的检测方式以Gap-PCR技术和PCR-RDB技术为主,但是这些检测技术只能检测已知的CNV或SNV,且对于CNV和SNV只能分开检测,操作过程复杂。本研究旨在应用多重PCR测序技术对CNV和SNV的α-地中海贫血和β-地中海贫血进行同时检测,并可发现未知突变,为后期地中海贫血的检测提供基础,也为其他遗传性疾病的诊断和预防提供参考和研究方向。方法收集来自福建医科大学附属医院和中山大学附属第一医院经过临床确诊的128例样本。首先根据地中海贫血基因设计多重PCR引物,将128例样本提取的DNA用设计的地贫引物池进行多重PCR扩增,将扩增产物进行文库构建,再将文库构建产物进行上机测序,最后对测序数据进行分析,再利用Gap-PCR和Sanger测序进行验证。结果在这项研究中,我们开发了一种新算法,使用NGS数据同时检测目标CNV和SNV。在该算法中,我们使用Align MAQ＞10将测序读数对准特定位置并去除错配。为了检测CNV,使用33个非缺失型样品作为对照值来构建基线,用A,B,C和D比率代表-SEA,-α4.2,-α3.7和复合或纯合缺失型别。为了检测其他SNV,使用系统软件分析后,再将变异位点用Annovar软件进行注释。在我们的研究中,共检测到11种SNV,其中8个SNV在Clinvar数据库中有收录,为明确的致病位点。其他3个未在Clinvar数据库中记录,为非同义突变,另外检测到66个良性突变位点。本研究使用A比率＜0.8,B比率＜0.4,C比率＜0.8,D比率＜0.002来鉴定-SEA,-α4.2,-α3.7缺失和复合或纯合型别。共检测到61个-SEA杂合缺失型,12个-α4.2杂合缺失型,38个-α3.7缺失型,20个纯合缺失型别。敏感性分别为96.72%（59/61）,83.33%（10/12）,97.37%（37/38）和 95%（19/20）,特异性分别为93.94%（31/33）,100%（33/33）,93.94%（31/33）和 100%（33/33）。结论在本研究中,我们选择具有CNV和SNV类型的地中海贫血作为我们的研究模型,验证多重PCR-NGS技术可以检测疾病特异性基因中的CNV和SNV。对于SNV的检测,使用Sanger测序验证,符合率为100%。发现了 3个未在Clinvar数据库中记录的SNV,丰富了地中海贫血突变数据库。对于CNV的检测,尽管在该研究中未实现100%的准确性,但是使用随后的验证技术（例如Gap-PCR技术）可以减少假阴性并且可以减少假阳性。总之,我们的研究证明了使用NGS数据检测目标SNV和CNV的可行性。该策略使用多重PCR和NGS作为常规方法,但需要对算法和技术方面进行进一步研究。
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