稠李花色苷的制备及生物活性研究

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稠李(Padus racemosa)为蔷薇科(Rosaceae)稠李属落叶乔木,其种类繁多,在我国分布广泛,资源丰富,其果实成熟日期在每年5月至10月,核果近球形,直径长度约8-10毫米,味道苦涩略有甜味。稠李果实营养丰富,含有多种成分,果皮为红褐色至紫色,花色苷含量较多。花色苷是天然的水溶性色素,由于其具有的降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等生物活性,已成为国内生物学、食品科学和药学研究的热点,其巨大的市场价值和应用前景也日益受到广泛的关注。现在,国内对稠李属植物的研究多在植株生长特性及栽培繁育等方面,有关稠李花色苷研究也主要为花色苷的制备。因此,本研究拟以稠李属稠李为原料,制备稠李花色苷,并对其生物学活性进行研究,以期为稠李花色苷的开发及深加工转化奠定基础。本研究以稠李果实为原料,采用有机溶剂法、超声波法、酶法三种方法提取稠李花色苷,并进行比较研究,确定其最优的制备方法。通过大孔树脂的动态、静态吸附和解吸实验,确定AB-8大孔树脂分离纯化稠李花色苷的最优条件;研究物理因素中的光照、温度、pH值,化学因素中的过氧化氢、维生素C、蔗糖,金属离子钠、钙、铝影响稠李花色苷稳定性的情况。化学水平上采用DPPH法、水杨酸法、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法进行自由基清除试验,检测稠李花色苷的抗氧化活性;细胞水平上,采用形态学观察稠李花色苷对Ins-1细胞的保护情况,MTT法检测稠李花色苷对Ins-1细胞存活率的影响,DCFH-DA荧光探针法检测Ins-1细胞内活性氧(ROS)的变化,流式细胞仪法检测稠李花色苷对Ins-1细胞凋亡情况的影响;最后在动物水平上,注射STZ建立高糖高脂小鼠模型,检测小鼠的血糖值、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)的含量。结果表明:有机溶剂法制备稠李花色苷的最优条件是物料比1:20、乙醇75%、温度75℃、时间1.5 h,得到的花色苷含量为0.792±0.012 mg/g;超声波法制备稠李花色苷的最优条件是物料比1:30、乙醇60%、功率300 W、时间45 min,得到的花色苷含量为0.897+0.023 mg/g;酸性纤维素酶法制备稠李花色苷最优条件是温度60℃、酶量9 mg/g、物料比1:35、pH 3.5,得到的花色苷含量为0.956+0.027 mg/g,通过三种方法的比较,确定酸性纤维素酶法制备稠李花色苷的效果最好。AB-8大孔树脂法对稠李花色苷进行静态、动态的纯化,获得最优静态条件是:粗提液8 mg/mL,温度20℃,50 mL花色苷粗提液中加入8g树脂,解吸剂70%乙醇,pH 3,温度60℃,纯化后色价是31.4;最优动态条件是:粗提液8 mg/mL,吸附流速0.01 mL/s,过柱2次;解吸剂70%乙醇,解吸流速0.01 mL/s,pH 3,纯化后色价是57.1。两种方法比较,动态纯化效果较好。而对稠李花色苷进行有关稳定性的探究,可得出物理因素光照、温度、pH值对花色苷的稳定性都影响较大,花色苷应当在酸性条件下进行低温、避光保存;化学因素氧化剂过氧化氢对花色苷稳定性有较大影响,储存的时候应该远离氧化剂,还原剂维生素C、食品添加剂蔗糖及三种金属离子钠、钙、铝对花色苷的稳定性影响较弱。稠李花色苷具有较强的抗氧化能力,在一定的范围内,能够清除DPPH、·OH、O2-·三种自由基,且其抗氧化能力呈现剂量一效应关系,但是,花色苷的清除能力要弱于维生素C;通过形态学观察和MTT实验,表明稠李花色苷能够保护Ins一1细胞,增加其存活率;采用DCFH-DA荧光探针法进行检测,结果表明稠李花色苷能够降低细胞内的活性氧;流式细胞仪法检测Ins-1细胞的凋亡情况,表明稠李花色苷能够抑制细胞凋亡;最后,动物水平结果表明,高、低剂量稠李花色苷都具有显著的降血糖效果和一定的降血脂功效,但其确切机制还有待进一步研究。
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