目的：微血管病变是糖尿病脑血管病并发症的病变基础,血管内皮细胞功能和结构的改变在糖尿病微血管病变的发生与发展中起着重要的作用。而血管通透性的增高是糖尿病微血管病变的一个标志性事件,是其发生的最初表现和导致其他后续改变的病理基础。晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)是一组在蛋白质的氨基和糖的醛基之间非酶性糖基化反应产物的总称。在糖尿病微血管病的发生过程中,AGEs大量堆积是导致糖尿病内皮细胞损伤的重要原因。本研究通过利用AGEs刺激的小鼠,利用免疫组织化学、免疫荧光、蛋白磷酸化检测、激酶特异性抑制剂和通透性测定的方法,在整体水平研究在AGEs引起的脑血管通透性增高中,血管内皮细胞moesin蛋白及其磷酸化在其中的作用,探讨AGEs引起moesin改变的上游信号转导通路。对moesin在AGEs介导的脑微循环内皮细胞功能变化中作用的阐明,将有助于探讨AGEs相关疾病,特别是糖尿病性脑血管病以及糖尿病性肾病等其他的糖尿病并发的微血管病的发病机制,为临床防治提供理论依据。方法：1. AGE-MSA的体外制备将小鼠血清白蛋白(MSA)、葡萄糖(D-Glucose)溶解在磷酸盐缓冲液PBS (pH7.2,0.4mol/L)中,再加入青霉素和庆大霉素等。终浓度：葡萄糖0.2 mol／L、MSA3.5mg/mL、青霉素90.3 U／mL、庆大霉素0.07 mg/mL、PMSF 50μmol/L、EDTA 0.001 mol/L、叠氮钠0.001 mol/L。混合物用0.2μm滤器过滤,放置在37℃,8周。以相同条件但不含葡萄糖的缓冲液孵育的鼠血清白蛋白作为对照。8周后将混合液用Millipore 15 mL超滤柱浓缩,Pierce Endotoxin Removing Gel去内毒素,Millipore 0.22μm滤器除菌。用荧光分光光度法测定AGEs含量。AGE-MSA中含有AGEs 80.50 U/mg protein,而对照的天然小鼠血清白蛋白中只含有AGE 0.79 U/mg protein。2.小鼠的实验分组及处理符合国家实验动物标准的SPF级雌性C57BL／6小鼠120只,10-12周龄,16～20g。1)实验小鼠分成四组：对照组、AGE-MSA组、p38 MAPK抑制组和ROCK抑制组。2)处理方法：a.对照组：每天定时腹腔注射MSA(10mg/kg),连续注射7天。b. AGE-MSA组：每天定时腹腔注射AGE-MSA (10 mg/kg),连续注射7天。c. p38 MAPK抑制组(SB203580+AGE-MSA):每天定时腹腔注射p38 MAPK的抑制剂SB203580 (1 mg/kg),半个小时之后,注射AGE-MSA (10 mg/kg)。连续注射7天。d. ROCK抑制组(Y27632+AGE-MSA):每天定时腹腔注射ROCK的抑制剂Y27632 (5 mg/kg),半个小时之后,注射AGE-MSA (10 mg/kg).连续注射7天。3.血脑屏障通透性的测定将各组C57BL／6小鼠用13.3%氨基甲酸乙酯加0.5%氯醛醣(0.65 ml/kg)肌肉注射麻醉背位固定。从小鼠尾静脉约10秒钟内注射3%伊文思蓝45 mg/kg。注射后小鼠全身变蓝,从而确认染料已经吸收和分布。伊文思蓝在小鼠体内循环1小时后,打开胸腔,剪开右心耳,通过左心室灌注生理盐水（灌注压为110mmHg),直到右心房流出的清亮液体。再通过左心室灌注预热的用PH3.5,0.05mol/L的柠檬酸缓冲液稀释的1%多聚甲醛(37℃)2 min。EB是一种四钠重氮染料,在体内或体外均可以定量地与白蛋白结合。EB静脉注射后,与血浆白蛋白以10：1的比例紧密地结合在一起。灌注的目的是冲洗血管中含伊文思蓝的血液,清除血管内的染料,避免其影响实验结果。PH值3.5有利于伊文思蓝和白蛋白的结合,温暖到37℃可以防止血管收缩。而选用pH3.5, 0.05mol/L的柠檬酸缓冲液稀释的1%多聚甲醛缓冲液灌洗是因其与白蛋白结合更加紧密,更能彻底清除血管内残留的EB。本实验通过匀浆法和冰冻切片两种方法从定量和定性两方面进行观察血脑屏障通透性的变化。匀浆法与冰冻切片的脑组织取材来自于同一小鼠大脑的前后两个部位。匀浆法：灌注后取出大脑,称量一半脑组织,获得湿重。将脑组织置于50%的三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)2ml中匀浆。匀浆液在4℃下,15000 r/min,离心20min后提取上清液(离心的目的是沉淀蛋白质,以免影响光密度值的测定)。以无水乙醇1：3稀释上清液后,在荧光分光光度计620 nm下,测定荧光值。通过外标准法计算每份样品的EB浓度：校零标准品为50%三氯乙酸按1：3加入无水乙醇。使用校零标准品配置不同浓度EB标准样品(31.25ng/ml～2000ng/ml),并作标准曲线(结果呈线性关系)。从标准曲线上计算样品浓度,定量每份脑组织抽提液的EB量。再与组织的质量相比,得到每克脑组织的EB含量。冰冻切片：灌注后,取一半大脑,快速进行冠状冰冻切片,8μm,隔4取1。避光晾干,用50%甘油-PBS封片。显微镜蓝色激发光下观察并拍片。4. Western Blot检测脑血管内皮细胞moesin及其磷酸化水平将小鼠麻醉后作打开颅腔,取脑,冰上去除软脑膜和白质。将剩余脑组织放入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液中,用组织匀浆机冰上匀浆共10 min,分三次,每次间隔1分钟。然后冰上静置裂解60min,离心取上清,采用Bradford法测定蛋白浓度。蛋白变性后采用Tris／甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法获得印迹膜,将用二抗结合后的印迹膜放入TBST中漂洗3×5 min后,滤纸小心吸干膜上液体,在膜上加适量配制好的ECL发光底物(Amersham,美国),使其于印迹膜充分作用接触,吸去多余液体,于柯达2000工作站曝光显影保存。5.免疫组化分析各器官组织血管内皮细胞noesin及其磷酸化水平将小鼠各器官组织取出,经固定后石蜡包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复后采用两步法检测各器官组织血管内皮细胞moesin蛋白及其磷酸化的水平,在400倍光镜下观察并拍片。利用Leaca Q500MC软件获取灰度值并进行统计。6.免疫荧光分析脑血管内皮细胞moesin及其磷酸化水平将小鼠各器官组织取出,经固定后石蜡包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复后,用荧光二抗进行孵育检测各器官组织血管内皮细胞moesin蛋白及其磷酸化的水平,在1000倍油镜下观察、拍片。利用Leaca Q500MC软件获取灰度值并进行统计。结果1 AGE-MSA对小鼠血脑屏障通透性的影响及机制1.1 AGE-MSA对血脑屏障通透性的影响对照组伊文思蓝的渗出量是0.809-0.045(μg/g脑组织),AGE-MSA组伊文思蓝的渗出量是1.224±0.072(μg/g脑组织),AGE-MSA组血脑屏障伊文思蓝的渗出量较对照组显著增多(P<0.05),结果提示AGE刺激后引起了血脑屏障内皮细胞屏障功能的破坏和通透性的升高。1.2 AGE-MSA刺激后脑血管内皮细胞Moesin及其磷酸化水平的变化Western Blot结果显示AGE-MSA组的小鼠脑微血管内皮细胞moesin的磷酸化水平较对照组显著增高(P<0.05),但：moesin蛋白的水平无显著增高(P>0.05)。提示AGE刺激引起了moesin磷酸化水平显著增高。免疫组化和免疫荧光结果显示：AGE-MSA组脑微血管内皮细胞的phos-moesin染色程度(与moesin比较)较对照组强,提示其磷酸化水平增加。2 AGE-MSA诱导的脑微血管内皮细胞moesin磷酸化的上游信号通路研究2.1抑制p38 MAPK通路对AGE-MSA介导的moesin磷酸化的影响结果显示,与对照组相比,AGE-MSA刺激的小鼠脑微血管细胞p38 MAPK的磷酸化水平显著提高(P<0.05)；SB203580+AGE-MSA组的phos-p38水平较单纯AGE-MSA刺激组显著降低(P<0.05),提示AGE-MSA刺激引起了p38 MAPK的磷酸化激活。在证明了AGE-MSA刺激导致了脑微血管内皮细胞moesin磷酸化的基础上,结果进一步显示,SB203580+AGE-MSA组的脑微血管内皮细胞moesin的磷酸化水平显著低于单纯AGE-MSA刺激组(P<0.05),提示p38 MAPK的磷酸化激活参与介导了moesin的磷酸化。2.2抑制ROCK通路对AGE-MSA介导的moesin磷酸化的影响结果显示,与对照组相比,AGE-MSA刺激的小鼠脑微血管细胞ROCK的磷酸化水平显著提高(P＜0.05); Y27632+AGE-MSA组的phos-ROCK水平较单纯AGE-MSA组显著降低,提示AGE-MSA刺激引起了ROCK的磷酸化激活。在证明了AGE-MSA刺激导致了脑微血管内皮细胞moesin磷酸化的基础上,结果进一步显示,Y27632预处理组的脑微血管内皮细胞moesin的磷酸化水平显著低于单纯AGE-MSA刺激组(P<0.05),提示ROCK磷酸化激活参与介导了moesin的磷酸化。2.3抑制p38和ROCK的磷酸化激活对小鼠脑血管内皮细胞屏障功能的影响SB203580+AGE-MSA组伊文思蓝的渗出值是0.855±0.045(μg/g脑组织),与AGE-MSA刺激组伊文思蓝的渗出值1.224±0.072(μg/g脑组织)相比有显著性差异(P<0.05),p38 MAPK阻断剂预处理显著减少了小鼠血脑屏障伊文思蓝的渗出,降低了血脑屏障的通透性；Y27632+AGE-MSA组伊文思蓝的渗出值是0.835±0.045(μg/g脑组织),与AGE-MSA组相比有显著性差异(P<0.05),ROCK阻断剂预处理显著减少了小鼠血脑屏障伊文思蓝的渗出,降低了血脑屏障的通透性。3 AGEs对肾、心和肝的moesin及moesin磷酸化水平的影响及其可能机制免疫组织化学的结果显示,对肾、心、肝的免疫组织化学结果显示,Moesin主要表达在各器官的血管内皮细胞。对照组各器官的磷酸化moesin含量轻微,几乎不可观察；AGE-MSA刺激的小鼠各组织器官磷酸化moesin的含量显著增加(P<0.05)；预先给予p38MAPK抑制剂或ROCK抑制剂的小鼠各组织器官内皮细胞磷酸化moesin虽然比对照组略微显著,但可见其组化染色深度显著低于单纯AGE-MSA刺激组(P<0.05)。结果提示,AGEs刺激可以导致各组织器官血管内皮细胞moesin的磷酸化,而p38 MAPK和ROCK的激活介导了moesin的磷酸化。结论：1. AGEs可引起脑微血管内皮细胞moesin的磷酸化,导致脑微血管通透性增加,表明糖尿病脑微血管病变中AGEs可能起着重要作用。2.p38 MAPK和ROCK信号转导通路参与了AGEs介导的moesin的磷酸化。通过抑制p38 MAPK和ROCK信号转导通路,可以防止小鼠脑微血管内皮细胞骨架蛋白moesin的磷酸化,降低脑微血管通透性的增加。3. AGEs刺激可以导致肝、肾和心等脏器血管内皮细胞moesin的磷酸化,而p38 MAPK和ROCK的激活介导了moesin的磷酸化。