大豆是我国重要的粮食作物和油料作物,大豆产量对于保障粮食生产安全和提高国民生活品质具有非常重要的意义。豆科植物与根瘤菌进行共生互作可以形成一种独特的器官——根瘤。根瘤中发生的生物固氮过程,在整个氮循环以及农业生产过程中扮演着非常重要的角色。目前在百脉根和苜蓿中已经基本建立起共生信号转导途径,但是对于信号途径中的基因,在大豆中却鲜有深入的研究。在百脉根和苜蓿中的共生信号转导途径中,NSP1是重要的转录因子,NSP2是重要的转录调节子,NSP1和NSP2调控了下游NIN、ERN1、ENOD11等共生信号响应基因的表达。但是,在大豆中有2个NSP1的同源基因GmNSP1a和GmNSP1b,它们发挥功能的独立性和冗余性是未知的。同时在大豆中3个NSP2的同源基因GmNSP2a、GmNSP2b和GmNSP2c的功能也是未知的。本文对大豆中GmNSP1和GmNSP2在调控根瘤数目方面的功能进行了初步研究,得出的主要实验结果如下:1.在大豆毛根中过表达GmNSP1a和GmNSP1b后,根瘤数目显著增加。通过RNAi载体沉默GmNSP1a和GmNSP1b的表达后,根瘤数目显著减少,表明GmNSP1a和GmNSP1b在根瘤发育过程中都起到正调控作用。2.在大豆稳定转化植株中分别过表达GmNSP1a和GmNSP1b后,根瘤数目相比野生型显著增加。在GmNSP1a和GmNSP1b的RNAi材料里,根瘤数目相比野生型显著减少。利用CRISPR-Cas9技术对GmNSP1a和GmNSP1b分别进行基因敲除,得到的突变体Gmnsp1a-1和Gmnsp1b-1,根瘤数目都有所减少但并没有表现出不结瘤的表型,这表明GmNSP1a和GmNSP1b在共生过程中的作用是有冗余的。在Gmnsp1a-1 Gmnsp1b-1的双突变材料中表现为不结瘤,表明GmNSP1a和GmNSP1b作为重要的转录因子对于大豆形成根瘤过程是不能同时缺少的。3.GmNSP1a和GmNSP1b在接种根瘤菌前后的转录组数据中表现出不同的表达模式:GmNSP1a在接种根瘤菌早期诱导表达,且在接菌10 d之后表达量有所下降。GmNSP1b在接菌8 d后表达量开始上调,在接菌20 d达到峰值。这表明大豆与根瘤菌共生过程中,不同的阶段可能涉及到不同的GmNSP1的参与。4.利用稳定转化的p GmNSP1a:GUS和p GmNSP1b:GUS材料,发现在接菌和不接菌条件下,GmNSP1a和GmNSP1b在根毛中都有表达。同时在根瘤原基和根瘤同时在根瘤原基和根瘤形成的过程中,也都检测到GmNSP1a和GmNSP1b的表达。表明GmNSP1a和GmNSP1b两个同源基因都有可能参与了根瘤菌与大豆共生过程中根毛变形、侵染线的形成和根瘤原基的起始过程。5.验证大豆中3个NSP2的同源基因中GmNSP2a的功能。利用CRISPR-Cas9技术对GmNSP2a进行基因敲除,在Gmnsp2a-1突变体中,根瘤数目减少,表明GmNSP2a在根瘤发育过程中起到正调控作用。6.为了进一步验证在大豆中GmNSP1和GmNSP2是否也能以二聚体的形式发挥作用,通过双分子荧光互补实验,发现GmNSP1a和GmNSP1b分别能和GmNSP2a和GmNSP2b互作,表明GmNSP1和GmNSP2在大豆中可能是以异源二聚体的形式发挥作用的。基于以上实验结果,我们认为在大豆与根瘤菌的共生过程中,GmNSP1和GmNSP2发挥的作用与苜蓿和百脉根中同源基因功能类似。不同于百脉根和苜蓿的只有单个NSP1基因,大豆中两个同源基因GmNSP1a和GmNSP1b都参与了大豆与根瘤菌的共生过程,表明GmNSP1a和GmNSP1b的功能是有冗余的。转录组数据中不同的表达模式表明GmNSP1a和GmNSP1b可能参与根瘤发育的不同阶段,协同完成整个根瘤发育过程。本文对于大豆的两个GmNSP1的同源基因的功能和机制的初步研究,丰富了大豆与根瘤菌共生固氮的基础研究,为后续进一步的研究奠定了一定的基础。