随着二次采油和三次采油技术的推广应用,油田采出水的处理难度也日益增大,微生物技术被认为是最具潜力的解决方法之一,而开发环境适应性良好的高效处理菌群是微生物处理技术的关键。然而,由于对处理菌群结构功能的演替规律,以及相关降解菌株对于毒性污染物响应机制的认识不足,造成了现有技术在实验室和实际工程应用之间处理性能和处理效率的差距,限制了油田采出水微生物处理技术的发展。在本论文中,我们主要研究了在重油采出水处理过程中土著菌群与环境因子的相互作用机制,以及分析了一株课题组前期从石油污染场地分离获得的菌株Sphingobium yanoikuyae XLDN2-5代谢氮杂环化合物的整体响应和调控机制。首先,本研究分析了土著微生物群落在处理重油采出水过程中的可塑性。重油采出水(Heavy oil-produced water,HOPW)因其所含污染物的难降解性和异质性,使之成为水处理领域的一个挑战。本研究在一个新建的日处理量为10,000 m3的HOPW处理厂,利用传统的厌氧-好氧(A/O)工艺对HOPW进行处理。在整个处理过程中不添加任何外源微生物及营养物质,仅通过人为控制溶氧浓度(Dissolved oxygen,DO)调节土著微生物群落处理HOPW。处理后,化学需氧量(Chemical oxygen demand,COD)由187.5±19.5 mg/l降至97.3±9.2mg/l,生化需氧量(Biochemical oxygen demand,BOD)、总氮和总磷分别降至5.5±3.1mg/l、3.8±0.6mg/l和0.28±0.09mg/l,达到了工艺设计标准。利用Illumina Mi Seq 16S r RNA基因测序综合分析了各处理阶段土著群落结构和功能的变化,发现在厌氧处理阶段,假单胞菌等具有降解性能的细菌、以及产甲烷菌等古菌的相对丰度较高,而在该阶段BOD增加248.5%,说明厌氧阶段的菌群能够显著提高HOPW的可生化性;而在好氧处理阶段,细菌的多样性更高,其中Halomonas spp.,Bacilli类菌株具有较高丰度,古菌则多为分类地位未知的菌株,在该阶段BOD降低了88%,平均39.1 mg/l,而在该阶段COD平均下降了40.0 mg/l,这说明好氧阶段菌群主要功能是降解BOD。上述结果表明,在HOPW处理过程中,不同处理阶段土著微生物群落的结构是不同的,而不同结构具有不同的功能,再次证明了土著微生物菌群具有良好的适应性和可塑性。其次,本文研究了石油中的模式氮杂环化合物——咔唑的整体代谢机制。鞘氨醇菌(sphingomonads)通常具有较高的遗传多样性,具有代谢多种类型难降解化合物的能力。S.yanoikuyae XLDN2-5是一株课题组前期从原油污染土壤中分离的典型的咔唑降解鞘氨醇菌,该菌株能够同时降解代谢多种石油中存在的杂环化合物。目前该菌种已保藏在德国菌种保藏中心(DSMZ),保藏编号为DSM28039。本研究采用2D-LC-MS/MS的方法测定了在咔唑或葡萄糖培养条件下该菌株的蛋白质组学数据,发现咔唑能够激活多个生物代谢通路的表达。在咔唑存在的条件下,有159个蛋白的表达上调,影响多个生物过程,如能量代谢、氨基酸的合成及代谢、糖的代谢及合成、嘌呤的代谢等。除此之外,通过q RT-PCR转录验证,我们确定了完整的咔唑降解基因簇。更为有趣的是,我们发现咔唑的存在会加速菌株XLDN2-5的生长。通过q RT-PCR检测在添加不同底物的条件下邻苯二酚间位裂解基因簇的表达情况发现,由于该簇的结构基因分布于三个独立的操纵子car DEFGHI、car JK和car LM上,使得各操纵子能够被独立调控。在咔唑存在下,car JK的表达比葡萄糖培养条件下高出24.8倍,同时中间代谢物2-oxypent-2,4-dienoic acid和4-hydroxy-2-oxovalerate的积累量比加入邻苯二酚或邻氨基苯甲酸的条件下分别少55和1,400倍。上述结果说明咔唑下游降解基因簇的特殊的组织形式使得菌株在代谢咔唑的过程中不大量积累毒性中间物,能够保证代谢的平衡,也是咔唑对XLDN2-5菌株生长起积极作用的主要原因。最后,我们初步研究了咔唑代谢上游基因簇的调控机制,并通过构建针对S.yanoikuyae XLDN2-5的CRISPRi基因表达调控抑制系统,发现d Cas9蛋白对该类菌株细胞具有致命的毒性。综上所述,本文系统地阐明了HOPW的土著菌群的结构和功能随环境条件变化的规律,证明了土著微生物群落具有良好的可塑性;发现了降解基因簇的分散性排列模式对底物选择偏好性的影响,阐明了鞘氨醇菌代谢咔唑的整体响应机制。本研究为难降解杂环化合物遗传元素的进化提供了新的视角,为开发适应性强的高效的油田采出水处理菌群提供参考。