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干旱是影响作物生长及限制作物产量的重要环境因素。植物响应干旱胁迫的关键步骤是在胞内ABA迅速积累，启动一系列适应胁迫的反应，包括气孔关闭、累积抗渗透物质、增强抗氧化防护系统提高干旱耐受性。有大量报道表明活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)作为第二信使介导了干旱胁迫下ABA诱导的适应胁迫的生理反应。高等植物中，双组分系统(two-component system，TCS)参与感知和应对多种环境刺激诱发的信号，是通过组氨酸激酶催化蛋白磷酸化与去磷酸化来感受、传递信号以响应外界环境的变化的一种信号系统。拟南芥中已有报道，干旱胁迫下ATHK1/AHK1位于ROS下游响应ABA信号调节质膜Ca2+通道引起气孔关闭。然而干旱胁迫下HKs是否参与ABA诱导的抗氧化防护未见有报道。本实验室前期，以ABA处理通过RT-PCR对OsHK家族的6个基因(OsHK1-6)进行筛选，发现OsHK3受ABA调控是通过ABA诱导产生的内源H2O2起作用的;另外证实OsHK3亦参与ABA调控的抗氧化防护途径。 基于上述的前期工作，为进一步阐明OsHK3在ABA调控的抗氧化防护通路中的作用，本研究在建立的水稻原生质体瞬时表达体系基础上，将构建的OsHK3过表达载体35S: OsHK3-YFP通过PEG融合介导入原生质体内，培养16小时后进行ABA处理。实验发现，转入35S: OsHK3-YFP过表达载体的原生质体与转入35S:YFP空载的对照相比，瞬时过表达OsHK3显著上调受ABA诱导的抗氧化防护信号通路中一些重要组分如蛋白激酶CCaMK、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及转录因子OsHsfA2、ZFP36的基因表达。另外通过PEG介导干扰OsHK3转录的dsRNA转化原生质体24小时后研究发现，瞬时沉默OsHK3明显降低OsDMI3（水稻中的CCaMK）、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及转录因子OsHsfA2、ZFP36的转录表达。反过来，原生质体中瞬时过表达35S:OsDMI3-YFP、35S:OsMPK1-YFP、35S:OsMPK5-YFP，对OsHK3的转录水平没有影响，且利用OsDMI3、OsMPK1的插入突变体验证，发现OsHK3对OsDMI3、OsMPK1的插入突变不敏感，即CCaMK、MAPK不影响OsHK3的表达。综上所述，ABA信号通路中，OsHK3调控受ABA诱导的OsDMI3、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及转录因子OsHsfA2、ZFP36的转录表达，且可能对CCaMK、MAPK的这种调控是不反馈的单线性调节。 为进一步探讨OsHK3在ABA诱导的抗氧化防护过程中与OsDMI3、OsMPK1的相互关系，我们利用OsDMI3、OsMPK1的插入突变体提取原生质体瞬时过表达OsHK3发现，与WT（野生型）相比，OsDMI3、OsMPK1突变体中瞬时过表达OsHK3不影响抗氧化酶SOD、APX的酶活性，且突变体中瞬时过表达OsHK3对ABA诱导SOD、APX的酶活升高没有明显影响。此结果表明OsDMI3、OsMPK1的插入突变阻断了OsHK3对ABA诱导的抗氧化防护的调控，OsHK3位于OsDMI3、OsMPK1的上游参与ABA诱导的抗氧化防护。 早前本实验室报道了OsDMI3、OsMPK1参与ABA信号通路中的RBOH介导的ROS放大正反馈机制。为了探明OsHK3是否亦参与了此正反馈机制，我们利用水稻原生质体瞬时表达与沉默OsHK3，检测受ABA诱导产生H2O2的NADPH氧化酶基因OsrbohB、OsrbohE的表达影响，以及用H2O2-敏感荧光探针H2DCF-DA标记瞬时干扰OsHK3的水稻原生质体，激光共聚焦显微镜下观察H2O2的产生结果显示:瞬时过表达OsHK3能显著上调OsrbohB、OsrbohE的转录表达，相反瞬时沉默OsHK3降低了OsrbohB、OsrbohE的转录水平，且阻断了ABA对OsrbohB、OsrbohE的诱导;瞬时沉默OsHK3后，与水对照相比，原生质体中H2O2的含量明显降低。结合早前H2O2诱导OsHK3的转录表达上调的实验结果，说明OsHK3参与了ABA信号通路中的RBOH介导的ROS放大正反馈机制，且通过介导ABA对OsrbohB、OsrbohE的诱导，影响了H2O2在胞内的积累。