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背景介绍心力衰竭(heart failure,HF)是一种心肌收缩障碍从而引起心脏泵血功能降低、心输出量减少的一种严重危害人类生命健康的疾病。研究发现在HF患者和HF实验动物模型中减压反射敏感性(baroreflex sensitivity,BRS)减弱,从而使发病率和死亡率增加。而压力感受反射(baroreflex)在心血管活动的调节中起着关键性的作用。实验显示升高正常狗或人血液中的醛固酮可以使减压反射明显降低,而HF可显著升高患者体内醛固酮。已有实验发现上皮细胞Na+通道(Epithelial sodium channel,ENaC)在减压神经中表达并感受血压变化,参与减压反射活动。HF大鼠以及升高大鼠体内醛固酮均可以使结状神经节(Nodose ganglia,NG)中ENaC蛋白的表达明显降低,而ENaC受醛固酮的调节。因此推测HF升高醛固酮,通过影响ENaC表达进而降低减压反射,但醛固酮降低ENaC的分子机制尚不清楚。MAPK信号通路是细胞信号通路中被广泛关注的信号通路之一,其中ERK在MAPK通路中起着关键性的作用。有研究表明ERK1/2信号通路参与在肾集合管上皮细胞中ENaC介导Na+的再吸,也有研究指出醛固酮能够激活ERK1/2信号通路。目的探讨大鼠HF状态下,醛固酮通过ERK1/2信号通路使减压神经处ENaC的表达和功能降低,进而使减压反射的敏感性降低。方法1、HF模型制备是结扎冠状动脉左前降支,6-8周后取材进行下一步实验。2、采用皮下植入渗透泵持续灌输醛固酮的方法制备醛固酮组大鼠模型,模型制备21天后进行后续实验。3、采用一连接微量泵(Picospritzer II)的玻璃微电极将病毒微量注射入大鼠的结状神经节(nodose ganglion,NG)中。4、雄性SD大鼠随机分为两大组,第一大组:(1)假手术组(sham,n=6)(2)心衰组(HF,n=6)(3)心衰加AAV介导的空载体sh RNA(HF+control sh RNA,n=6)(4)心衰加AAV介导的ERK1/2 sh RNA组(HF+ERK1/2 sh RNA,n=6)。第二大组:(1)溶剂组(control,n=6)(2)醛固酮组(Ald,n=6)(3)醛固酮加AAV介导的空载体sh RNA组(Ald+control sh RNA,n=6)(4)醛固酮加AAV介导的ERK1/2 sh RNA组(Ald+ERK1/2 sh RNA,n=6)。5、心衰模型制备6-8周后采用小动物超声检测大鼠心脏的生理变化。6、心衰模型制备6-8周后采用TTC染色检测大鼠心脏的组织学变化。7、测量各组大鼠血浆醛固酮浓度:采用醛固酮ELISA试剂盒测定各组大鼠新鲜动脉血血浆中醛固酮的浓度。8、减压反射敏感性的测量:股动脉插管用以测量各组大鼠的血压和心率,股静脉插管用以注射硝普钠(SNP)和苯肾上腺素(PE)分别诱导升压反射和降压反射,将反射前后收缩压变化值与心动周期变化值之比(ΔSBP/ΔCC)作为升压反射敏感性(BRS-SNP)和降压反射敏感性(BRS-PE)的指标。9、采用免疫印迹技术(western blot)的方法检测各组大鼠NG中ERK1/2,ENaC-β,ENaC-γ等蛋白表达量的变化。10、数据的统计学分析:实验所得数据均用Graph Pad Prism5.0统计软件做统计学分析,实验结果用均值±标准差(Mean±SD)来表示,用单因素方差分析和t检验,P﹤0.05为差异有统计学意义。结果1、心脏生理和病理学检测显示HF组大鼠较sham组的左心室功能降低,左心室梗死面积达到左心室30%以上。2、病毒注射21天后用Western Blot的方法检测各组大鼠NG中ERK2和ERK1蛋白的表达,结果显示大鼠NG中ERK2和ERK1的表达分别下调至对照组的5%和15%。3、HF模型制备成功后,各组大鼠体重无明显差别。而大鼠心脏/体重的值为:sham组(0.280±0.017),HF组(0.330±0.027),HF+Control sh RNA组(0.334±0.021),HF+ERK1/2 sh RNA组(0.324±0.029);测量各组大鼠左心室后壁厚度,结果显示:sham组(0.311±0.026 cm),HF组(0.392±0.022 cm),HF+Control sh RNA组(0.402±0.022 cm),HF+ERK1/2sh RNA组(0.405±0.027 cm),与sham组相比,HF组及HF处理组大鼠的心脏重量和左心室后壁厚度显著增加(P<0.05),而HF处理组与HF组之间无差别。表明HF伴有心肌肥大,而降低NG中的ERK1/2表达不能改变HF引起的心肌肥大。4、测量HF模型制备成功的各组大鼠的减压反射敏感性(BRS),结果为:sham组(1.147±0.21 ms/mm Hg),HF组(0.330±0.11 ms/mm Hg),HF+Control sh RNA组(0.378±0.08 ms/mm Hg),HF+ERK1/2 sh RNA组(0.665±0.08ms/mm Hg)。HF组,以及HF处理组的BRS明显比sham组低(P<0.001),降低HF大鼠NG中ERK1/2的表达可以减弱HF引起的BRS降低(P<0.001)。5、HF模型制备成功后,通过Western Blot的方法检测各组大鼠NG中ENaC-β和ENaC-γ蛋白的表达,计算条带灰度相对值,结果为:sham组分别为1.000±0.259和1.000±0.031,HF组分别为:0.187±0.083和0.061±0.004,HF+Control sh RNA组分别为0.152±0.029和0.067±0.043,HF+ERK1/2 sh RNA组分别为0.428±0.139和0.634±0.191,与sham组相比,HF组及HF处理组大鼠NG中ENaC-β和ENaC-γ蛋白的表达均明显减少(P<0.05),但HF+ERK1/2 sh RNA组与HF组相比ENaC蛋白表达量升高(P<0.05)。6、醛固酮组大鼠模型制备21天后,检测各组大鼠血浆中醛固酮浓度,结果显示:Control组(246.6±24.49 pg/ml),Ald组(550.0±76.00 pg/m),Ald+Control sh RNA组(540.3±72.97 pg/m),Ald+ERK1/2 sh RNA组(533.4±81.42 pg/m)。Ald组和Ald处理组血浆醛固酮浓度是溶剂组的2倍以上。7、醛固酮组模型制备成功后,检测各组大鼠的ERK2和ERK1的蛋白表达,计算条带灰度值,结果显示:Control组分别为1.000±0.194和1.000±0.289,Ald组分别为0.758±0.046和0.888±0.191,Ald+Control sh RNA组分别为0.856±0.302和0.731±0.135,Ald+ERK1/2 sh RNA组分别为0.227±0.064和0.219±0.086,与其他三组相比Ald+ERK1/2 sh RNA组的ERK1/2蛋白明显下调。8、醛固酮组大鼠模型制备成功后,大鼠的体重,心脏/体重的值,左心室后壁厚度均无明显差距。9、醛固酮组大鼠模型制备成功后,各组大鼠的BRS分别为:Control组(1.114±0.22 ms/mm Hg),Ald组(0.332±0.09 ms/mm Hg),Ald+Control sh RNA组(0.326±0.09 ms/mm Hg),Ald+ERK1/2 sh RNA组(0.619±0.09 ms/mm Hg),与Control组相比,其他三组的BRS明显降低(P<0.001),Ald+ERK1/2sh RNA组的BRS与Ald组相比明显升高(P<0.001)。10、醛固酮模型制备成功后,用Western Blot的方法检测各组大鼠NG中ENaC-β和ENaC-γ蛋白表达情况,结果:Control组分别为1.000±0.138和1.000±0.190,Ald组分别为0.196±0.028和0.073±0.021,Ald+Control sh RNA组分别为0.211±0.076和0.082±0.021,Ald+ERK1/2 sh RNA组分别为0.418±0.065和0.635±0.195,与Control组相比,其他三组NG中ENaC-β和ENaC-γ蛋白表达均明显减少(P<0.05),Ald+ERK1/2 sh RNA组与Ald组相比ENaC蛋白表达量升高(P<0.05)。结论1.结扎冠状动脉左前降支诱导大鼠心衰模型,引起心肌肥大和心功能降低,抑制NG中ERK1/2的表达不能改善心肌病理性变化;2.HF和升高大鼠醛固酮激活了NG中的ERK1/2,降低NG中ENaC-β和ENaC-γ蛋白表达,减弱减压反射敏感性;3.AAV介导的sh RNA抑制NG中ERK1/2的表达,部分恢复NG中ENaC-β和ENaC-γ蛋白表达,改善减压反射。这些结果结合以前的研究表明,心衰大鼠升高醛固酮水平,通过激活NG中的ERK1/2,降低了ENaC蛋白的表达,从而使BRS减弱。