二化螟Bt毒素受体蛋白—氨肽酶N和钙粘蛋白基因的克隆及在昆虫细胞系的表达

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cs19890126
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二化螟Chilo suppressalis(Walker)是严重威胁我国水稻生产的重要害虫。近年来,受耕作制度和种植结构的改变、高产优质水稻品种的大面积种植、天气等原因的影响,二化螟的发生逐年加重,而且由于化学农药长期大量反复的使用,使其抗药性明显上升,更加难以防治。转Bt基因水稻的出现为防治二化螟提供了新的有效的方法,但是从生物学角度来看,昆虫对转基因作物产生抗性是一种胁迫进化现象。因此,研究Bt毒杀二化螟的机理、二化螟对Bt产生抗性的可能机制,可以为将米转基因水稻的推广、制定抗性治理策略、延长转基因水稻的使用期限等提供重要的理论依据。本论文研究了二化螟Bt毒素的主要受体—氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)和钙粘蛋白(Cadherin,CAD),利用PCR结合RACE技术的方法得到了二化螟中肠APN和钙粘蛋白基因的全长序列,并在昆虫杆状病毒表达系统中成功的进行了表达。主要结果如下:利用PCR结合RACE技术的方法得到了二化螟中肠氨基氨肽酶N基因的全长序列,同时利用PCR技术得到钙粘蛋白基因的全长序列。其中APN经数据库比对鉴定为氨肽酶N基因家族的1个成员,其基因全长已在GENEBANK登记,登录的序列号为:DQ342305,基因全长3292bp,编码1075个氨基酸,其C端有一段25个氨基酸组成的片段,具有亲脂性和跨膜特性;钙粘蛋白基因在GENEBANK登录的序列号为:DQ821523,基因全长5148bp,编码1715个氨基酸,有16个钙粘蛋白重复域,与欧洲玉米螟等其他鳞翅目昆虫钙粘蛋白具有较高的同源性,同源性达73%。昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的表达。该系统具有许多优点,如多角体启动子控制下的高效表达,比较完善的转录后加工修饰,容易从细胞中纯化,无内毒素污染等。将APN和钙粘蛋白的基因克隆到Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTb中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTb/目的基因;并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/目的基因;转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(Tn-5B1-4),获得含目的基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得到表达的蛋白。经过SDS-PAGE分析和点杂交结果显示,APN和钙粘蛋白基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了表达,且均为Cry1Ab的受体蛋白。
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